【摘 要】
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[目的]明确TP63基因不同亚型在重型痤疮皮损及健康对照组织中的表达差异,并利用构建的体外细胞模型探讨差异表达的TP63基因亚型对细胞增殖、炎症因子释放等痤疮相关表型的影响及其可能的作用机制,探讨TP63基因在重型痤疮发生发展中的作用,为疾病预警预测和防治应用奠定理论基础。[方法]利用全转录组测序数据分析重型痤疮皮损组织及健康对照皮肤组织中TP63基因不同转录本的表达差异。用qRT-PCR检测Ha
【基金项目】
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国家自然科学基金（81760559）；
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[目的]明确TP63基因不同亚型在重型痤疮皮损及健康对照组织中的表达差异,并利用构建的体外细胞模型探讨差异表达的TP63基因亚型对细胞增殖、炎症因子释放等痤疮相关表型的影响及其可能的作用机制,探讨TP63基因在重型痤疮发生发展中的作用,为疾病预警预测和防治应用奠定理论基础。[方法]利用全转录组测序数据分析重型痤疮皮损组织及健康对照皮肤组织中TP63基因不同转录本的表达差异。用qRT-PCR检测HaCaT细胞株中TP63亚型的本底表达。利用慢病毒转染构建稳定过表达ΔNP63α及过表达对照、敲减TP63及敲减对照的细胞株（OE-ΔNP63α株和OE-NC株、sh-TP63株和sh-NC株）。用qRT-PCR和Western blot检测细胞株的敲减和过表达效率。用CCK8法检测各细胞株增殖活性。用流式细胞术检测各细胞株凋亡和细胞周期的变化。用qRT-PCR检测各细胞株中炎症因子IL-6、IL-8的表达变化和痤疮丙酸杆菌刺激各细胞株后炎症因子的表达变化。利用全转录组测序数据筛选TP63敲减细胞株差异表达的基因,结合前期重型痤疮皮损转录组测序数据筛选表达变化趋势一致的差异基因,通过GO、KEGG pathway富集差异基因涉及的功能及信号通路,探讨TP63影响痤疮相关表型的机制。[结果]1.重型痤疮皮损转录组测序共检测到TP63基因亚型的12个转录本是编码蛋白的mRNA。12个mRNA转录本中10个是已知的亚型,其中ANp63α亚型在重型痤疮组中的表达较对照组减少,且差异具有统计学意义（FC=0.48,P＜0.05）,ANp63β亚型的表达差异在重型痤疮组中有一定下调（FC=0.66）,但差异无统计学意义。其余转录本在多个皮肤组织样本中的表达量极低。2.qRT-PCR结果显示在HaCaT细胞株中ΔNP63α亚型表达高,TAp63低表达;CCK8结果显示与过表达对照组相比,ΔNP63α过表达显著抑制了 HaCaT细胞增殖活性（P＜0.05）,而与敲减对照组相比,TP63敲减显著促进HaCaT细胞的增殖活性（P＜0.05）;细胞周期检测结果显示,与过表达对照组相比,ΔNP63α过表达组处于S期的细胞比例明显降低（P＜0.05）,G0/G1和G2/M期细胞在两组细胞间无显著差异;与敲减对照组相比,TP63敲减对细胞周期的影响没有明显差异;检测细胞的凋亡情况,结果显示,与过表达对照组细胞相比,ANP63α过表达呈现促进HaCaT细胞凋亡趋势;而与敲减对照组相比,TP63敲减呈现抑制凋亡的趋势,细胞的早凋亡和总凋亡水平具有相同的趋势,但差异无统计学意义。3.痤疮丙酸杆菌刺激HaCaT细胞株后可以显著上调细胞中IL-6和IL-8的mRNA表达水平;与敲减对照组相比,痤疮丙酸杆菌刺激后,TP63敲减组IL-6 mRNA的表达显著上调;与过表达对照组相比,ANp63α过表达组中IL-8 mRNA的表达显著下调。4.在HaCaT细胞转录组测序结果中显示TP63敲减及敲减对照组中共有844个基因有显著差异,其中有600个基因差异表达显著上调（FC＞1.64,P＜0.05）,244个差异基因表达显著下调（FC＜0.58,P＜0.05）;TP63敲减细胞株及重型痤疮皮损转录组测序数据得到差异表达趋势一致的基因58个,其中均上调基因47个,均下调基因11个;GO分析结果显示富集到IL-6生物合成过程的调控、白细胞迁移等过程。KEGG pathway分析结果显示富集到补体和凝血级联信号通路、Toll样受体信号通路等。[结论]1.TP63基因的亚型ΔNP63α在重型痤疮皮损中表达下调。2.下调的ΔNP63α可促进体外角质形成细胞的增殖活性。3.ΔNP63α亚型可影响炎症因子IL-6、IL-8的表达。4.下调的ΔNP63α亚型可能经由补体和凝血级联信号通路影响细胞增殖活性,进而参与重型痤疮中毛囊漏斗部角质形成细胞过度增殖。5.下调的ΔNP63α亚型可能经由Toll样受体信号通路影响炎症因子释放,进而参与重型痤疮中的炎症反应过程。
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