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背景:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivlis,Pg)是牙周炎的关键致病菌(keystone-pathogen),其分泌的毒力因子牙龈素(gingipain,G)具有多方面的功能,对牙周炎的发生发展起到极为重要的作用,其可激活补体C5a-C5a受体(C5a receptor,C5aR)信号通路,诱发并加剧宿主牙周组织的免疫炎症反应,对牙周组织产生分解破坏作用。低分子量C5aR拮抗剂PMX205是一种人工合成的能靶向阻断C5a-C5aR轴的环六肽,这种多肽通过模拟C5a的活性C末端氨基酸残基,在多种炎症模型中表现出良好的抗炎效果,推测其对牙周炎具有治疗作用。单核/巨噬细胞是宿主非特异性免疫系统的重要组成部分,在动员牙周的防御机制抵抗致病菌感染中发挥关键作用,具有天然免疫与抗原呈递等功能。巨噬细胞能根据外界微环境的不同分化出不同表型和功能,表现出很强的可塑性,其中包括M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞两种极端表型。M1型巨噬细胞的杀菌能力增加,能诱导和扩大炎症,释放活性氧(reactive oxygen species,ROS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)等杀菌物质,产生的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1,IL-1β)和IL-6等细胞因子起到促炎及刺激破骨细胞,促进骨破坏的作用;M2型巨噬细胞低表达NO,高表达转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和IL-10等抑炎因子,能促进血管生成和组织的修复再生。有学者发现用牙龈卟啉单胞菌感染小鼠时,主要是M1型(CD86+)巨噬细胞浸润牙龈组织,另一方面将氯膦酸二钠脂质体静脉注射到小鼠体内使得单核/巨噬细胞耗尽后,能通过调节宿主免疫反应抑制Pg感染和牙槽骨吸收。有关PMX205对G或Pg诱导的巨噬细胞极化的影响目前尚未见报道,因此,本研究通过体外细胞炎症模型实验,从极化的角度探讨PMX205在小鼠巨噬细胞中的抗炎作用。方法:1.PMX205细胞毒性检测PMX205分别与小鼠巨噬细胞(RAW264.7)及人成骨细胞(MG63)共培养,采用MTT法检测PMX205对细胞生存和增殖的影响,评价PMX205的细胞毒性。2.PMX205对牙龈素诱导的炎症模型的影响RAW264.7与牙龈素体外共培养模拟炎症环境,观察PMX205的抗炎效果。实验分为6组:阴性对照组、G组、G+PMX205(0.1、1、5、10μg/ml)组,24h后采用Real-time PCR、ELISA和Griess法检测M1型巨噬细胞标志(iNOS(NO)、IL-6及TNF-α),M2型巨噬细胞标志性细胞因子(IL-10和TGF-β1)在基因和蛋白水平的表达;流式细胞术检测M1型巨噬细胞标志性表面分子CD86及M2型巨噬细胞标志性表面分子CD206的表达情况;吞噬实验检测PMX205对RAW264.7吞噬能力的影响。3.PMX205对牙龈卟啉单胞菌诱导的炎症模型的影响实验分为3组:阴性对照组、Pg组和Pg+PMX205组,共培养24 h,采用Real-time PCR、ELISA及Griess法检测巨噬细胞相关细胞因子的表达水平。结果:1.MTT检测显示随着细胞培养时间的增加,浓度为0.001、0.01、0.1、1、5μg/ml的PMX205的光吸收值(A)相应增加,对RAW264.7细胞毒性均为0或1级,但10μg/ml在24 h时对RAW264.7细胞毒性为2级,与空白对照组有统计学差异(P<0.05)。各浓度组PMX205对MG63细胞毒性均为0或1级。2.PMX205对牙龈素诱导的炎症模型的影响与阴性对照组相比,G组IL-6和TNF-α的mRNA表达水平明显增高,而IL-10表达明显降低(P<0.01);G+PMX205不同浓度组IL-6和TNF-α的mRNA表达水平低于或显著低于G组(P<0.01或P<0.05),而iNOS、IL-10和TGF-β1的基因表达水平显著高于G组(P<0.01)。确定最佳浓度(1μg/ml)并采用此浓度的PMX205用于RAW264.7细胞,ELISA及Griess检测显示,用G刺激的实验组IL-6、TNF-α、NO及IL-10蛋白表达较无刺激物组显著升高(P<0.01);G+PMX205组TNF-α的表达较单纯G组显著降低(P<0.01),而IL-10和TGF-β1的蛋白分泌水平较G组显著升高(P<0.01)。流式细胞术结果表明:用牙龈素刺激RAW264.7细胞,G组M1型巨噬细胞标志性表面分子CD86的单阳率表达升高,而M2型巨噬细胞标志性表面分子CD206的单阳率显示下降;PMX205能使用牙龈素刺激的RAW264.7细胞CD86单阳率较G组下降,而CD206单阳率增加。与未经处理的细胞相比,用G预处理的RAW264.7增加了对大肠杆菌的吞噬作用。用G和PMX205共同预处理的RAW264.7吞噬的大肠杆菌比单纯的G组更多。3.PMX205对牙龈卟啉单胞菌诱导的炎症模型的影响Real-time PCR检测结果表明,Pg刺激引起IL-6、TNF-α和IL-10表达水平较无刺激物组显著升高(P<0.01);PMX205能使用Pg刺激的RAW264.7细胞的IL-6和TNF-α表达显著低于单纯Pg组(P<0.01),而iNOS和IL-10的表达显著高于Pg组(P<0.01)。ELISA及Griess结果显示,Pg组IL-6、TNF-α及NO表达较阴性对照组明显增高(P<0.01);Pg+PMX205组IL-6和TNF-α表达显著低于Pg组(P<0.01),而NO表达较Pg组升高(P<0.01)。结论:1.PMX205细胞毒性低,生物安全性好;2.PMX205通过调控巨噬细胞极化对牙龈素引起的炎症反应有抗炎作用;3.PMX205对牙龈卟啉单胞菌引起的炎症反应有抗炎作用。