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研究背景目前大面积烧伤患者治疗上遇到的最大问题在于供皮区有限,无法快速修复创面。近年来,自体种子细胞组织工程皮肤的出现为解决这一问题又提供了新思路,但其最重要的种子细胞——角质形成细胞,无法在体外快速增殖,导致组织工程皮肤的发展及临床应用受到限制。因此,如何促进角质形成细胞体外快速增殖成为其关键环节。既往研究表明ROCK抑制剂能抑制人胚胎干细胞在分离过程中诱导的凋亡,后续不少学者发现,ROCK抑制剂Y-27632对骨髓间充质干细胞、牙周膜上皮细胞、角膜内皮细胞等均有促进增殖、延缓衰老、抑制分化的作用;还能影响细胞的旁分泌作用,增强其分泌多种细胞因子的能力。本课题组既往研究表明,脐带间充质干细胞与角质形成细胞直接共培养和间接共培养时均可促进角质形成细胞的增殖Y-27632可促进脐带间充质干细胞增殖,延缓其衰老。而间充质干细胞条件培养液也被证实具有促进靶细胞增殖、影响细胞分化潜能的作用。在体试验中,Y-27632及间充质干细胞条件培养液对创面修复也有积极影响。但目前尚未见Y-27632对人头部刃厚皮片来源角质形成细胞增殖和衰老的影响,也无Y-27632刺激后人脐带间充质干细胞条件培养液对角质形成细胞增殖和衰老影响的报道。研究目的通过研究Y-27632对无血清无异种细胞培养条件下人角质形成细胞增殖、衰老及迁移的影响,以及Y-27632刺激人脐带间充质干细胞后制备的条件培养液对角质形成细胞增殖、衰老及迁移能力的影响,探讨体外快速扩增人角质形成细胞的方法。研究方法1.从头部刃厚皮片中分离获得人角质形成细胞（KC）,将细胞随机分为对照组和Y-27632组,分别在DKSFM和添加了 5μM Y-27632的DKSFM中进行传代培养。观察细胞的形态、生长情况并进行细胞生物学鉴定。对各组细胞进行形态学观察;免疫荧光染色法检测细胞表面标志物CK14及β1-整合素的表达。MTT法测OD值以检测细胞增殖能力及活性;β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老情况;划痕试验检测各组细胞迁移能力。2.从人脐带中分离获取人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）,将hUC-MSCs培养至60%-70%融合后,随机分为Y-27632条件培养液组和单纯干细胞条件培养液组,将获得的hUC-MSCs在含和不含5μM Y-27632的DMEM培养基中培养,48h后收集干细胞培养上清液制备干细胞条件培养液,ELISA法测定两组干细胞条件培养液中EGF及VEGF含量;用DMEM培养基（对照组）及上述两组条件培养液处理角质形成细胞,MTT法测OD值检测细胞增殖能力及活性;划痕试验检测各组细胞迁移能力;β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老情况。结果1.从人头部刃厚皮片中分离出具有增殖活性和干性的人角质形成细胞,表达CK14及β1-整合素。而且在实验中发现原代KC在培养至融合度为30%～40%时,每天更换1次培养液较每2-3天换1次培养液,能延缓KC在体外培养过程中的老化,获得更多活力旺盛的KC;若2-3天换液一次,在培养至第3代后KC就会迅速膨大衰老,不利于KC的大量扩增。Y-27632可显著促进原代KC分离培养过程中的KC贴壁,而对KC细胞形态无明显影响。（1）Y-27632可促进角质形成细胞增殖。MTT试验结果显示:Y-27632组OD值明显高于对照组（P＜0.05）,证实Y-27632组细胞增殖能力及细胞活性高于对照组。（2）Y-27632可延缓角质形成细胞衰老。β-半乳糖苷酶染色结果显示:对照组衰老细胞明显较多,β-半乳糖苷酶阳性细胞占比达（20.719±4.405）%,而Y-27632组阳性细胞占比仅为（12.424±1.043）%（P＜0.01）。（3）Y-27632可促进角质形成细胞迁移。划痕试验结果显示:不同时间点Y-27632组划痕愈合百分比均高于对照组（P＜0.01）。2.从人脐带中分离人脐带间充质干细胞。（1）Y-27632刺激后脐带间充质干细胞培养上清液中EGF和VEGF含量较单纯干细胞培养上清液中明显增多（P＜0.01）。（2）Y-27632增强干细胞条件培养液对角质形成细胞的增殖作用。MTT结果显示:单纯干细胞条件培养液组及Y-27632刺激后干细胞条件培养液组OD值均高于未加条件培养液的对照组;且Y-27632刺激后干细胞条件培养液组OD值高于单纯干细胞条件培养液组（P＜0.05）。（3）脐带间充质干细胞条件培养液延缓角质形成细胞衰老。β-半乳糖苷酶染色结果显示:对照组β-半乳糖苷酶阳性细胞占比达（21.936±5.260）%,两组干细胞条件培养液组则分别为（16.684±1.194）%及（13.947±3.773）%,与对照组相比均有统计学意义（P＜0.05）,但两组干细胞条件培养液组相比较无统计学意义（P＞0.05）。（4）Y-27632增强干细胞条件培养促进角质形成细胞迁移。单纯干细胞条件培养液组及Y-27632刺激后干细胞条件培养液组不同时间点划痕愈合百分比均高于未加条件培养液的对照组;且Y-27632刺激后干细胞条件培养液组效果更显著（P＜0.01）。结论1.从人头部刃厚皮片中可分离获得具有增殖活性和干性的人角质形成细胞。ROCK抑制剂Y-27632可显著促进原代KC分离培养过程中KC贴壁,对KC形态无明显影响。2.ROCK抑制剂Y-27632可显著促进无异种血清和无异种细胞培养条件下KC增殖和迁移,延缓其衰老。3.ROCK抑制剂 Y-27632 可刺激hUC-MSCs 分泌 EGF 和 VEGF。hUC-MSCs条件培养液能促进KC增殖和迁移,延缓其衰老;且Y-27632可显著增强hUC-MSCs条件培养液对KCs增殖和迁移的作用。