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纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)可以在只含有结晶纤维素滤纸的无机盐培养基中生长,或者以木聚糖为唯一碳源培养基中生长。S.cellulosum So0157-2是本实验室分离得到的产埃博霉素的重要菌株,其基因组测序发现含有多个木聚糖降解酶编码基因。对S.cellulosum.So0157-2基因组中木聚糖酶进行生物信息学预测分析时发现,其中的一个木聚糖酶Xyn11B除了具有糖苷水解酶11家族(GH11)保守的催化域这一常规结构域外,其他区域或者序列则具有特殊性,包括:N-端具有引导蛋白锚定于细胞内膜或者外膜上的典型的脂蛋白信号肽(Ⅱ型信号肽),而不是常规的引导蛋白分泌于细胞外的Ⅰ型信号肽;在信号肽与GH11催化域之间为一段不常见的、丝氨酸残基数达到86%(51/58)的聚丝氨酸区(Polyserine linker,PSL);序列比对还显示较常规GH11序列而言,催化域中有两段明显的插入序列;不具有一般内切木聚糖酶中常见的底物结合区(CBM)等。这些特殊性使Xyn11B在S.cellulosum So0157-2丰富的木聚糖酶中成为我们关注的重点,开展了深入的研究。前期的实验发现Xyn11B在大肠杆菌的多个载体中表达均发生降解,无法获得目的蛋白,而只表达催化域时发现,不仅可以获得目的蛋白,而且具有酶活。表明PSL的有无影响着蛋白的稳定性。采取将PSL截短的方式来进一步研究PSL的长度和序列对目的蛋白的影响。将Xyn11B的PSL进行随机截短,构建了 8个PSL截短体,在pGEX-6P-1中表达,除S48和S61在用Ppase切除GST标签后,目的蛋白发生降解,无法获得目的蛋白之外,其他截短体均可获得不同稳定程度目的蛋白。发现PSL保留越完整,目的蛋白越易于被降解,携带PSL越短,目的蛋白越稳定。证明PSL的存在与否及其不同的长度影响着目的蛋白的稳定性,并且发现PSL的存在可是木聚糖酶耐受酸性环境。目前尚无法建立序列特征与蛋白稳定性之间的关系。通过分析PSL截短突变体的酶学性质,发现PSL的存在可以使蛋白耐受强酸性。上述结果为进一步分析该蛋白在原始菌株S.cellulosumSo0157-2中的存在形式、稳定性调节和功能发挥奠定了基础,为获得可进行研究和应用的稳定性蛋白提供了依据。在构建PSL截短体以及测定其酶学性质时发现,位于催化域N-端的一段氨基酸序列,能够显著提高酶的最适作用温度。D111的最适温度为65℃,而Xyn11B-C(T131)的最适温度为40℃,二者相差20个氨基酸,最适温度相差25℃。影响最适温度的因素有很多,包括氢键、离子键、芳香环的疏水作用、二硫键等。通过分析Xyn11B的三维结构图发现,在Y123-T131之间存在纵横交错的氢键网,无法准确定位到某一个或者某几个氨基酸;而在这段氨基酸序列上却有三个酪氨酸残基,分别为Y123,Y126,Y130,推测苯环之间的相互作用导致最适温度显著提高。采用定点突变的方法,进一步确定了这段序列中Y126与催化域中W346之间在空间上邻近而产生的相互作用(Y126与W346)对最适温度的提高具有显著的影响。通过测定突变体的温度耐受发现,Xyn11B-S、Y126A/Y130A能够耐受高温,在100℃处理60min之后仍存在酶活;而Y130A不能耐受高温,在70℃处理20min后,酶活显著降低;W346A突变体也不能耐受高温,在60℃处理5min后酶活几乎完全丧失,说明Y130、W346对于该蛋白的热稳定性具有重要的影响。Y123-T131之间的氨基酸序列显著提高最适温度的作用是否通用性我们选取了来自纤维堆囊菌So0157-2的Xyn1 1C作为改造对象,其最适温度为40℃,属于中温性的木聚糖酶。将Y123-T131之间的序列分别添加到成熟蛋白dlp-Xyn11C和催化域Xyn11C-C上。发现其最适温度分别提高了 6℃和8℃,说明无论将该序列直接添加到整个序列或者催化域上均能显著提高其最适温度。但是测定其温度耐受时发现,仍不能耐受高温。本论文采用序列删除截短或定点突变的研究方法,结果证明芳香环间的相互作用在该蛋白最适温度的提高方面发挥显著作用。为酶的最适温度及耐热性的改造,适应相应的应用目标提供一定的理论依据和思路。前期的实验发现,表达的Xyn11B催化域Xyn1 1B-C作用于桦木木聚糖时产物只有木二糖。对Xyn11B-C晶体结构进行解析时发现,同Trichoderma reesei Xylanase XYNⅡ相比,Xyn11B催化域中的两段插入序列在酶结构的"拇指"附近成为loop,命名为loop1和loop2。因为GH11木聚糖酶的"拇指"被认为在催化反应中起关键的作用,所以推测这两段loop是导致Xyn11B-C酶解木聚糖产物为木二糖的原因。前期实验将loop1缩短至四个GH11家族木聚糖酶共有氨基酸之后,酶活完全丧失,与产物为木二糖无关;,本研究中将Xyn11B-C中loop2删除,构建缺失loop2的突变蛋白Xyn11B-S2,TLC进行产物图谱分析时发现,其产物不再是木二糖,而为一系列低聚寡糖。表现出典型的内切木聚糖酶的特征。该结果表明loop2的存在是Xyn11B产物为单一木二糖的原因。本研究的结果为改造木聚糖酶,生产特定产物谱的木寡糖提供了一种思路。