【摘 要】
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植物SABATH甲基转移酶是一类催化植物激素和小分子化合物甲基化的酶,通过催化水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）等植物重要激素甲基化,参与植物激素的信号传导。已有研究表明,SABATH甲基转移酶基因在植物次生代谢、生长发育、防御反应过程中发挥重要作用。其中茉莉酸（JA）和茉莉酸甲酯（MeJA）在花穗发育、信号传导、真菌以及害虫防御反应的研究已取得很大进展。已有研究表明茉莉酸信号传导及代谢途径能诱导水稻
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植物SABATH甲基转移酶是一类催化植物激素和小分子化合物甲基化的酶,通过催化水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）等植物重要激素甲基化,参与植物激素的信号传导。已有研究表明,SABATH甲基转移酶基因在植物次生代谢、生长发育、防御反应过程中发挥重要作用。其中茉莉酸（JA）和茉莉酸甲酯（MeJA）在花穗发育、信号传导、真菌以及害虫防御反应的研究已取得很大进展。已有研究表明茉莉酸信号传导及代谢途径能诱导水稻对褐飞虱的抗性,但对其调控机制的认识还很少。本文以四个受MeJA诱导的水稻甲基转移酶基因为研究对象,利用分子生物学技术手段,初步研究它们在水稻响应生物（褐飞虱）及非生物胁迫反应中的作用,为明确水稻SABATH甲基转移酶基因的生物学功能,以及防御基因的挖掘奠定基础。本研究通过基因芯片分析鉴定了四个受MeJA强烈诱导的水稻SABATH甲基转移酶基因,暂时将其命名为:OsSAMT1,OsSAMT2,OsSAMT3,OsSAMT4。利用分子克隆技术获得了基因序列,并初步研究了这四个SABATH甲基转移酶基因在水稻中的生物学功能,主要工作内容如下:1、利用qRT-PCR分析验证了OsSAMTs基因均受MeJA诱导,并且在水稻不同组织的表达量有所差异,OsSAMT1,OsSAMT2和OsSAMT3在水稻茎中表达量最高,而OsSAMT4主要在花中表达较高。在一定时间内OsSAMTs的表达量随褐飞虱取食水稻时间逐渐升高。在JA信号缺陷的水稻材料中OsSAMTs对MeJA的诱导响应受到抑制。2、构建sGFP亚细胞定位载体和原核表达载体。GFP融合表达载体在水稻原生质体瞬时表达分析发现OsSAMTs均定位在细胞质中。原核表达载体在0.5mM的IPTG诱导4小时后,GST和His标签融合OsSAMTs蛋白的表达量最大,形成包涵体蛋白。3、克隆OsSAMTs基因上游2.5kb左右序列作为启动子序列,并与GUS基因连接得到OsSAMTs:GUS载体,获得启动子转基因株系。通过GUS组织化学染色,观察发现OsSAMT2/3/4在水稻根、茎、叶、花和种胚中都有不同程度的表达。MeJA能够显著诱导OsSAMT2和OsSAMT3在水稻叶片中的表达,机械损伤和褐飞虱取食也能诱导OsSAMT2和OsSAMT3在水稻茎中的表达升高。暗示OsSAMT2和OsSAMT3可能参与JA信号传导和褐飞虱诱导的水稻防御反应。4、构建OsSAMTs的超表达载体、OsSAMTs-CRISPR/Cas9载体,并获得转基因株系。利用PCR分析鉴定超表达株系,测序分析OsSAMTs-RISPR/Cas9转基因株系的突变位点,获得了纯合突变的OsSAMTs-CRISPR/Cas9转基因株系。对OsSAMTs的超表达和纯合突变株系进行褐飞虱抗性鉴定,发现OsSAMT1在水稻防御褐飞虱反应过程中起正调控作用,而OsSAMT2和OsSAMT3起负调控作用。5、利用双荧光素酶报告系统进行启动表达分析,发现JA信号途径的重要转录因子OsMYC2能够激活OsSAMT2启动子的表达,但不能调控OsSAMT3和OsSAMT4基因的表达。为了进一步明确JA信号传导途径是否通过OsMYC2来调控OsSAMTs的表达,从而影响水稻对褐飞虱的抗性,我们构建并获得了OsMYC2-Cas9转基因突变株系,用于分析OsSAMTs的表达及对褐飞虱的抗性。
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