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目的利用兔骨髓间充质干细胞作为种子细胞,分别诱导为心肌样细胞和内皮细胞,于体外构建血管化组织工程心肌组织,为临床上通过组织工程与细胞移植技术治疗心肌梗死这一疾病提供理论基础和技术支持。方法1选取普通级日本大耳白兔,无菌分离双侧股骨及胫骨,采用Percoll分离液分离兔骨髓间充质干细胞并使用流式细胞仪鉴定其表面标志物CD90、CD105和CD45。使用内皮细胞条件培养基(Endothelial cell culture medium,ECM)对兔骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞,采用免疫细胞化学染色的方法对表面标志物CD34和CD31进行鉴定。显微镜下观察兔骨髓间充质干细胞和内皮细胞的形态学变化。2使用5-氮胞苷对兔骨髓间充质干细胞定向诱导为心肌样细胞,免疫细胞化学染色的方法对表面标志物心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,c TNT)进行鉴定,并于显微镜下观察诱导后细胞的形态学变化。3分别使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenylindole,DAPI)和氯甲基苯甲酰氨(Chloromethylbenzamidodialkylcarbocyanine,CM-DIL)标记心肌样细胞和内皮细胞。4将诱导后获得的心肌样细胞与内皮细胞按照不同比例进行共培养(1∶0、0∶1、1∶1、1∶2)。5将不同组的细胞接种至Matrigel基质胶和胶原海绵两种支架材料上,观察细胞-支架材料复合物的血管化形成能力。6采用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行统计学分析,计量资料使用均数±标准差(sx±)的形式表示,多个样本的均数之间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05表示具有显著性差异。采用Graph Pad Prism 8.0软件进行图形的绘制。结果1通过流式细胞仪技术检测可观察到使用Percoll分离液的方法可获得兔骨髓间充质干细胞,CD90和CD105表面标志物呈现为阳性表达,CD45为阴性表达,显微镜下可观察到48小时的兔骨髓间充质干细胞形态为透亮圆形、折光性较强,第1代的兔骨髓间充质干细胞,细胞长短伸展不一,形态多为短梭形,内含少量杂质细胞,第2代的兔骨髓间充质干细胞,细胞呈现为梭形,第3代的兔骨髓间充质干细胞,细胞体积较起始细胞体积大,形态变为长梭形,多边形。2使用内皮细胞条件培养基(ECM)对兔骨髓间充质干细胞诱导后可获得内皮细胞,经免疫细胞化学染色的方法进行鉴定,结果表明诱导后的细胞表达CD31和CD34,显微镜下可观察到内皮细胞在48小时后部分细胞开始贴壁,细胞形态大小不一致,呈现条索样变化;传至第1代时,细胞形态变为短小细条索状,有少许透亮点;待细胞进行第2次传代,可观察到细胞数量较前明显增多,排列为“铺路石样”改变;传至第3代,细胞为长梭形改变。3 DAPI荧光染料标记心肌样细胞,可观察到细胞核标记为蓝色,CM-DIL荧光染料标记内皮细胞,可观察到细胞膜标记为红色。4使用10umol/L的5-氮胞苷对兔骨髓间充质干细胞定向诱导为心肌样细胞,经免疫细胞化学染色的方法进行鉴定,观察到诱导后的细胞心肌标志物c TNT表达为阳性,经5-氮胞苷诱导24小时的细胞形态呈现为多角形,分布不均,生长缓慢,诱导3天后,细胞体积较前增大,诱导5天后,细胞开始伸出长短不一的伪足,诱导7天后细胞伸出明显伪足,偶有相互连接,细胞胞体呈现为高亮状态,诱导3周,细胞之间聚集数量逐渐减少,诱导1月可观察到细胞形态发生明显变化,细胞数量明显减少。5体外构建细胞-支架材料复合物,将不同组别的细胞接种至Matrigel基质胶上,可观察到心肌样细胞与兔骨髓源性内皮细胞以1∶2共培养条件下的血管网状结构的形成能力最强,而在胶原海绵支架材料上只观察到细胞在胶原海绵生长,无血管网状结构的形成。结论1使用内皮细胞条件培养基诱导兔骨髓间充质干细胞可获得内皮细胞。2 5-氮胞苷诱导兔骨髓间充质干细胞可获得心肌样细胞。3体外构建血管化细胞-支架材料复合物,支架材料的选择上Matrigel基质胶相比较胶原海绵更合适。4细胞-支架材料复合物形成血管化的能力上,心肌样细胞与内皮细胞以1∶2比例进行共培养条件下的血管网状结构的形成能力最强。图15幅;表2个;参118篇。