论文部分内容阅读
目的：1.研究脑缺血再灌注后不同时点线粒体自噬、线粒体氧化应激水平、线粒体失功能的动态变化。2.研究雷帕霉素（RAP）预处理对脑缺血再灌注后线粒体损伤的影响以及其具体作用机制。方法：1.利用线栓法制备MCAO模型，结合电镜、LC3免疫组化染色及western-blot定量分析手段，观察再灌后不同时点线粒体自噬表达规律。分离纯化大鼠缺血侧皮层神经细胞线粒体，并检测缺血再灌注后不同时点线粒体MDA、ATP、JC-1、mtDNA水平，观察脑缺血再灌注后线粒体相关功能及指标的变化。2.通过缺血前30分钟给予RAP0.8ng侧脑室注射预处理，于再灌后24小时通过TTC染色、神经行为评分、TUNEL染色来观察RAP预处理的神经保护作用，此外测定线粒体自噬、线粒体数目、线粒体MDA、ATP、JC-1等指标。3.检测RAP预处理后线粒体beclin1、p62表达的变化，检测细胞p-Erk1/2表达的变化，检测Cyt-c、Bax在线粒体蛋白和胞浆蛋白的表达差异。结果：1.电镜观察到脑缺血再灌注诱导神经元自噬及线粒体自噬显著表达，western-blot定量分析结果显示线粒体自噬在再灌后6小时即出现，再灌后24小时达到高峰，可持续到再灌后72小时。缺血再灌注导致线粒体MDA持续升高，线粒体膜电位持续下降，mtDNA拷贝数减少、ATP合成能力下降，但在再灌后24小时mtDNA拷贝数、ATP合成能力较再灌注后6小时有升高（P＞0.05）。2. RAP预处理组梗死体积、神经行为评分均显著优于对照组（P＜0.05），RAP预处理组线粒体MDA水平明显下降（P＜0.05），线粒体功能改善（ATP合成能力提高，线粒体膜电位好转，P＜0.01）。3.RAP预处理后线粒体自噬增加，神经元线粒体数目及mtDNA拷贝数增加。4.RAP预处理组线粒体beclin1、p62表达增加，细胞p-Erk1/2下调， Bax线粒体转位下降，细胞色素C释放减轻，细胞凋亡指数显著降低（P＜0.01）。结论：1、线粒体自噬在脑缺血再灌注后表达显著增高，是细胞对缺血再灌注氧化应激损害的一种适应性机制，2、RAP预处理对缺血再灌注有显著的神经保护作用，该作用与促进线粒体自噬相关。强化的线粒体自噬能够降低线粒体氧化应激损伤，改善线粒体功能、增加线粒体数量。3.RAP预处理主要是通过刺激线粒体上调表达beclin1、p62来激活线粒体自噬，4.RAP预处理除激活线粒体自噬外还能抑制线粒体凋亡通路，可能与RAP抑制细胞内Erk1/2磷酸化激活相关。