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研究背景:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是全球难治性疾病,主要病理特征是气道及肺组织的慢性炎症,吸烟是其主要的发病原因之一。目前西医临床以支气管扩张剂、糖皮质激素及茶碱类药物作为COPD的主要治疗手段,目前这些药物在控制急性发作及感染方面疗效显著,但仍有很多局限性,虽然能暂时缓解患者的临床症状,但是常常伴有不同程度的副作用。针刺疗法作为中国传统医学的一部分,在改善COPD患者肺通气、提高患者生活质量方面疗效确切,但作用机制不明确。有研究表明针刺的免疫调节作用可能与激活了胆碱能抗炎通路(CAP)有关。研究目的:本课题以肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)为研究对象,以香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导AM形成细胞炎症模型,通过α-银环蛇毒素(α-BGT)阻断CAP的关键环节α7nAChR,分析COPD针刺血清对AM炎性因子及α7nAChR后NF-κB、JAK2/STAT3信号通路的作用。以期从离体实验证实CAP参与针刺治疗COPD的抗炎作用,为电针治疗COPD提供实验依据。研究方法:(1)本实验采用香烟烟熏加气管滴注脂多糖(LPS)的方法复制COPD大鼠模型,从大鼠的肺功能和病理切片评价是否造模成功,对模型大鼠进行电针治疗一周后提取针刺血清;(2)提取原代AM,以台盼蓝拒染实验、姬姆萨染色、免疫荧光方法进行细胞鉴定;提取CSE,用CCK-8的方法检验CSE对AM的细胞毒性;(3)将细胞分为6个组:正常对照组(Control),香烟烟雾提取物组(CSE),香烟烟雾提取物+针刺血清组(CSE+serum),α-BGT+针刺血清组(α-BGT+serum),α-BGT+香烟烟雾提取物+针刺血清组(α-BGT+CSE+serum),针刺血清组(serum)。(4)采用ELISA检测针刺血清对CSE诱导AM上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的作用;(5)采用Rea-ltime PCR及Western-Blot法检测针刺血清对AM中α7nAChR、NF-κB、JAK2、STAT3的mRNA及蛋白表达。研究结果:(1)COPD模型组大鼠FEV0.1、FEV0.3、FEV0.1/FVC、FEV0.3/FVC均低于正常对照组(P<0.05);模型大鼠肺组织病理切片则见气道慢性炎症、肺泡结构改变、分泌物增多。(2)提取的细胞经鉴定为AM,且20%CSE的浓度诱导AM炎性细胞模型效应较佳;(3)以ELISA方法观察AM上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。结果显示,CSE组比control组含量升高(均P<0.05);加入针刺血清后,CSE+serum组的含量降低;阻断α7nAChR后,α-BGT+CSE+serum组的含量升高(均P<0.05),表明针刺血清对CSE诱导的AM有抗炎效应,且该效应可能是通过α7nAChR发挥的;此外,serum组比control组含量有升高(P<0.05),阻断α7nAChR后,α-BGT+serum组含量进一步升高(P<0.05),提示针刺血清对未经CSE诱导的AM有促炎效应,且此效应可能不是通过α7nAChR发挥的。(4)Reatime PCR方法观察AM的α7nAChR、NF-κB、JAK2、STAT3的mRNA表达。结果显示,CSE组比control组表达上调(均P<0.05);加入针刺血清后,CSE+serum组表达进一步升高(P<0.05);而阻断α7nAChR后,α-BGT+CSE+serum组表达下降(P<0.05)。此外,serum组比control组表达上调(P<0.05),阻断α7nAChR后,α-BGT+serum组表达下调(P<0.05)。以上结果均提示针刺血清能上调α7nAChR、NF-κB、JAK2、STAT3的mRNA表达,且该作用可能通过α7nAChR发挥的。(5)以Western-Blot方法观察AM中α7nAChR、NF-κB、JAK2、STAT3的蛋白表达。结果显示,CSE组比control组表达增高(均P<0.05);加入针刺血清后,CSE+serum组表达均降低(P<0.05);而阻断α7nAChR后,α-BGT+CSE+serum组表达降低(P<0.05)。此外,serum组比control组蛋白表达增高(P<0.05);阻断α7nAChR后,α-BGT+serum组表达下降(P<0.05)。以上结果均提示针刺血清能下调AM中α7nAChR、NF-κB、JAK2、STAT3的蛋白表达,且作用与α7nAChR激活有关。结论:(1)用烟熏加LPS气管滴注的方法建立的模型大鼠符合COPD临床病理及肺功能特点,本研究成功制备COPD模型大鼠;(2)CSE成功诱导AM释放IL-1β、TNF-α、IL-6炎性因子,炎症细胞模型成立。AM炎症状态下,针刺血清可以通过α7nAChR降低炎性因子的释放,有抑制炎症效应;AM正常状态下,针刺血清有促炎作用,且此作用与α7nAChR无关。(3)CSE可以激活胞内α7nAChR、NF-κB、JAK2、STAT3的mRNA及蛋白表达;病理状态下,针刺血清可通过α7nAChR后NF-κB、JAK2/STAT3信号通路起到抗炎作用,正常状态下,针刺血清可激活其作用,且不通过α7nAChR发挥作用。展望:针刺血清和α-BGT作为外源性蛋白,其本身作为外源蛋白对AM也具有刺激作用,其也可能会通过细胞膜上其它受体来激活胞内其它信号通路,导致炎性表达升高。针刺血清上调α7nAChR、NF-κB、JAK2、STAT3mRNA表达,但下调了其蛋白表达,可能与转录后修饰有关,其可能原因为AM细胞核内某些修饰蛋白在翻译过程中受到针刺血清干预后上调,参与了蛋白的剪切,导致蛋白量降低,具体存在哪些调节因子,还需进一步研探究。