粉葛是豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii（Benth.）的干燥根,具有抗氧化和神经保护等药理活性,主要有效成分为葛根素、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷等黄酮类化合物,其中葛根素是药效指标成分,2020年版《中国药典》规定粉葛干燥品葛根素含量不少于0.30%。葛根素属于黄酮碳苷,大部分碳苷具有不同于氧苷的独特药理活性。糖基转移酶是植物中广泛存在的酶,能够将糖供体的糖基转移到糖受体的特定位点上,根据与糖受体结合的原子种类可分为碳苷、氧苷、氮苷、硫苷等。碳苷转移酶是糖基转移酶的一种,能让糖供体糖基部分结合到糖受体上,形成碳苷产物。以碳苷转移酶为基础的生物合成是生产碳苷的主要方式之一。寻找其他植物的碳苷转移酶有助于生物合成新的碳苷,而阐释碳苷转移酶的酶促反应机制有助于了解酶的反应特点、鉴别反应关键氨基酸,有助于酶改造和提高产率、扩大底物谱等。目前已有几十种植物的碳苷转移酶被揭示,如光果甘草（Glycyrrhiza glabra）、野葛（Pueraria lobata）、荞麦（Fagopyrum esculentum）。公开的碳苷转移酶蛋白或复合物晶体结构超过10个,但粉葛的碳苷转移酶及其酶促反应机制研究尚未见报道。葛根素是粉葛的重要化学成分,但粉葛中将大豆苷元转为葛根素的碳苷转移酶尚处未知状态。本研究拟筛选克隆粉葛将大豆苷元转为葛根素的碳苷转移酶并验证,解析其酶促反应机制并对其底物谱进行考察,为葛根素生物合成及其调控机制研究奠定基础。本研究基于粉葛全基因组序列,利用基因家族鉴定方法筛选出105种葡萄糖基转移酶,进一步从中筛选出11种碳苷转移酶,再通过分子对接方法最终鉴定了3种可将大豆苷元转为葛根素的碳苷转移酶候选基因,并利用体外催化反应对其活性进行验证。在此基础上,利用分子动力学模拟方法对其催化功能和机制进行了初步预测,并利用药物虚拟筛选、体外催化等方法考察了酶的底物谱。主要研究结果如下:1.粉葛基因组中葡萄糖基转移酶的筛选通过对粉葛全基因组序列进行分析,从中筛选出105个葡萄糖基转移酶家族成员,这些基因在粉葛的11条染色体上均有分布。利用生物信息学等手段对葡萄糖基转移酶的理化特征进行了分析,结果发现氨基酸序列长度在180-608 aa之间,蛋白分子量在19.67-67.17 k Da之间,跨度较大。其中100个蛋白的等电点小于8,推测与蛋白的保守基序相关。家族成员表现出明显的保守基序规律,种类和排列顺序为motif4-motif5-motif10-motif6-motif2-motif5-motif7-motif1-motif3-motif9-motif8,亲缘关系越近的成员其基序结构相似度越高。亚细胞定位预测显示,84%的蛋白定位在叶绿体和细胞质,16%的蛋白可能在细胞膜和细胞核上。2.葛根素碳苷转移酶的筛选根据葡萄糖基转移酶筛选结果,利用基因家族分析方法,参照其他物种的碳苷转移酶基因特征,从粉葛葡萄糖基转移酶中筛选出11个碳苷转移酶候选基因。对照motif分析结果,发现蛋白PIUGT4、PIUGT3、PIUGT7、PIUGT8缺少关键motif,认为其为假基因或无功能转录本,保留7个候选基因。对照染色体定位分析结果,发现PIUGT10和PIUGT11在不同染色体上分布;对照亚细胞定位分析结果,PIUGT1被定位在细胞膜上,PIUGT2同时被定位在细胞膜和细胞核上。利用Rosetta Fold对剩余7个蛋白结构进行预测,在此基础上利用Auto Dock vina 1.2.2将蛋白与UDPG、大豆苷元同时与蛋白进行分子对接,分析复合物构象,结果发现PIUGT2、PIUGT5和PIUGT9可能是以大豆苷元为底物的碳苷转移酶。为全面分析,对候选基因PIUGT1、PIUGT6蛋白性质列入后续分析:多序列比对,发现其同源性达到61.85%;对这5个基因进行了氨基酸长度、理论等电点、亲水性、信号肽、跨膜区、二硫键的分析;最后利用Interpro软件,对蛋白-配体结合过程的关键氨基酸残基进行了预测。3.葛根素碳苷转移酶的功能鉴定利用RT-PCR方法从粉葛中克隆了3个候选基因序列,利用基因合成方法构建了基因的原核表达重组载体p ET32a（+）-PIUGT2、p ET32a（+）-PIUGT5、p ET32a（+）-PIUGT9。利用大肠杆菌原核表达系统对基因编码蛋白进行异源表达,通过体外酶促实验验证3个蛋白催化功能,结果表明3个蛋白均以UDPG作为糖供体、p H 8.0、30℃的条件下可将大豆苷元转化为葛根素。4.葛根素碳苷转移酶酶促反应分子动力学预测利用Amber等软件,基于分子对接的复合物构象进行了分子动力学模拟研究,对MM/PBSA、RMSD、RMSF、距离进行了分析。结果发现,分子动力学模拟过程RMSD趋于平稳,3个复合体系都能较快地达到平衡态。PIUGT2蛋白的氨基酸残基Gly19、His20、Asp118、Leu119、Phe140、Pro188、Arg288、Asn371和Glu375、PIUGT5蛋白的氨基酸残基Ile15、Glu17、His20、Asp122、Ser144和Ser145、PIUGT9蛋白的氨基酸残基Pro90、Ile94、Thr153、Trp341、Asn363的RMSF较低,柔韧性差;PIUGT2、PIUGT5和PIUGT9的总结合能大小分别为-28.6236±7.75kcal/mol、-61.89±9.57kcal/mol、-42.58±7.73kcal/mol;综合RMSF、MM/PBSA和结合模式分析,总结了反应关键氨基酸,其中PIUGT2的Asp118、PIUGT5蛋白的Asp122为对应反应的关键氨基酸,而PIUGT9的对应Asp为非关键氨基酸。3个蛋白与配体的相互作用均以氢键为主,其他相互作用种类包括疏水相作用、供体-供体相互作用等。蛋白与UDPG的相互作用数量均多于与大豆苷元间相互作用数量。综合MM/PBSA、RMSF分析结果,预测3个蛋白发生酶促反应的容易顺序为:PIUGT5＞PIUGT9＞PIUGT2。5.葛根素碳苷转移酶底物虚拟筛选和验证通过收集粉葛已报道的化合物信息,利用Chem Draw、Pub Chem等工具建立了粉葛化合物结构数据库（35个化合物）,使用网上T3DB小分子结构数据库（3678个化合物）作为小分子结构库。利用smina、sdsorter软件对3个蛋白的底物进行虚拟筛选及其结果排序。对染木料素、鸢尾黄素等10个粉葛报道的化合物,以及Nystatin、Rifabutin等9个T3DB数据库中化合物,利用PIUGT2、PIUGT5和PIUGT9蛋白进行体外酶促验证,但未发现能发生酶促反应的底物。本文尝试通过分子对接寻找碳苷转移酶候选基因,发现粉葛中将大豆苷元转为葛根素的3个碳苷转移酶,并成功验证体外活性,揭示其酶促反应过程关键氨基酸;尝试将虚拟筛选思路用于酶的底物谱考察,为粉葛碳苷转移酶的应用奠定基础。