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目的:本研究采用磷酸组胺建立气道损伤模型,初步从整体、细胞等不同的水平验证麻杏石甘汤（MSD）抗气道损伤与调控EGFR/PI3K靶点的相关性,深化对其作用机理的认识,明确其物质基础,初步探讨含药肝孵育液法用于体外药效研究的可行性,为该方法在中药复杂体系体外药理研究的应用提供初步的支撑。方法:1.采用均匀设计法设计MSD（N1-N13组）不同的配伍比例,使用临床煎煮方法制备MSD药液。以氯化乙酰胆碱与磷酸组胺联合雾化建立大鼠急性哮喘模型,分别灌服MSD水煎液（N1-N13组）、地塞米松溶液和生理盐水（正常组和模型组）,记录大鼠引喘潜伏期;本实验共检测了13个配比的指标,但考虑到文章篇幅的原因,本文以平喘金指标—引喘潜伏期为参考,拟根据对引喘潜伏期影响最大、适中、较差的各2个组别,选择N4,N6,N7,N9,N10,N11以及N13组（记为Na-Ng组）展现实验结果。采用ELISA检测哮喘大鼠血清中细胞因子IL-2,IL-4,TNF-α的水平;HE染色、Masson染色和透射电镜法分别观察各药物组对哮喘大鼠气管组织上皮的病理变化和超微结构损伤的影响;采用TUNEL法检测大鼠气管上皮细胞凋亡;同时运用原位杂交法和Western Blot分别检测大鼠气管组织中EGFR的表达。2.以磷酸组胺刺激建立RTE细胞损伤模型,分为以下各组:正常组,模型组,地塞米松组,MSD含药肝孵育液N4,N6,N7,N9,N10,N11以及N13组（即,NaI-NgI组,分组原因同上）。以NaI-NgI组肝孵育液和地塞米松溶液孵育36h,分别使用RT-PCR及WB检测经抑制剂AG1478和LY294002预处理前后EGFR和PI3K的表达;流式细胞术检测RTE细胞的凋亡,荧光素DCFH-DA探针法检测抑制剂NAC处理前后RTE细胞活性氧自由基（ROS）含量的变化;运用跨细胞单层电阻值（TEER）和大分子透过率反应RTE细胞对牛血清白蛋白（FITC-BSA）的通透性。3.本课题组前期经分析得出了MSD水煎液和含药肝孵育液中差异性成分及含量的变化。明确了MSD水煎液的8个主要差异性成分,即麻黄碱（Ephedrine,E）、伪麻黄碱（Pseudoephedrine,PE）、甲基麻黄碱（Methylephedrine,ME）、苦杏仁苷（Amygdalin,AM）,甘草苷（Liquiritin,LQ）,甘草素（Liquiritigenin,L）,异甘草素（Isoliquiritigenin,ISL）和甘草酸铵（Ammonium Glycyrrhizin,AG）;以及MSD含药肝孵育液中有7个主要差异性成分,即E、PE、ME、AM、LQ、L和AG。现以主要差异性成分的含量为自变量（X）,各效应指标为因变量（Y）,采用SPSS21.0软件进行线性回归分析。4.本实验选择MSD临床常用剂量组,各采集3个批次的含药肝孵育液和含药血清数据,找到2者的差异性成分,计算各成分的含量并分析其RSD值。体外药效学实验分为正常组、模型组、含药肝孵育液（2.5%,5%,10%）和含药血清（2.5%,5%,10%）组,用磷酸组胺处理复制支气管上皮细胞损伤模型,分别给予相应药物孵育36 h后,Western blot检测各组磷酯酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的相对表达量,并计算RSD值。结果:1.整体动物实验结果表明,MSD各给药组皆可延长引喘潜伏期,其中Nf组延长引喘潜伏期效果最佳（P＜0.01）。ELISA结果表明,Nb组可显著升高哮喘大鼠血清中IL-2水平（P＜0.05）,Na-Ne组大鼠血清中IL-4水平显著降低,Na-Ng组均可显著降低TNF-α水平（P＜0.05）。透射电镜结果表明,模型组较正常组出现严重的病理变化,纤毛异常稀疏,未见细胞连接,核膜皱缩,核仁消失,细胞膜破裂,可见大量空泡;与模型组比较,其中Nd,Nf组纤毛较长且致密,可见细胞连接,核膜较完整,线粒体出现部分肿胀,接近地塞米松组。HE染色结果表明,Na-Ng组大鼠气管组织的病理形态有所改善,评分均明显降低（P＜0.01）。Masson染色结果表明,Na,Nc和Ne组可减少哮喘大鼠气管组织胶原纤维化（P＜0.05）。TUNEL法结果表明,Nd-Ng组均降低了哮喘大鼠气管上皮组织细胞凋亡率（P＜0.05）。原位杂交结果表明,除Na组外,其余组均降低EGFR m RNA表达（P＜0.01）。Western Blot结果表明,除Nb组外,其余各组均显著下调哮喘大鼠气管组织中EGFR蛋白的表达（P＜0.05）。2.流式细胞术实验结果表明,NcI-NgI组RTE细胞的凋亡均明显降低（P＜0.05）;NaI-NfI组均能降低RTE细胞中ROS的含量（P＜0.05）。RTE细胞通透性结果表明,模型组透过率升高、TEER显著降低（P＜0.01）,与图片一致;除NdI和NeI组外,其余组TEER均明显升高（P＜0.05）,且除NdI和NfI组外均可显著降低RTE细胞的透过率（P＜0.01）。RT-PCR结果表明,NaI-NgI组均能够显著下调RTE细胞中EGFR m RNA表达;Western blot结果表明,除NbI组外其余组别亦能显著下调EGFR的蛋白表达（P＜0.01）;NaI,NcI以及NeI-NgI组均能降低PI3K蛋白的表达（P＜0.05）。特异性抑制剂AG1478、LY294002和NAC预处理后,MSD含药肝孵育液可以协调相应的抑制剂下调RTE细胞中EGFR和PI3K的表达,降低ROS水平,初步表明MSD可阻断EGFR/PI3K的表达。3.MSD水煎液中八个差异性成分（E/PE-X1,ME-X2,AM-X3,LQ-X4,L-X5,AG-X6,ISL-X7）与大鼠整体实验（Na-Ng组）效应指标Y的相关性分析。自变量X2和X4被系统剔除,结果表明,成分与效应间的相关性较好。Y（引喘潜伏期）=157.258+0.064X1+5.980X3+364.708X5+216.660X6-45.463X7（R~2=0.891）Y（IL-2含量）=26.568+0.321X1+94.458X3-308.209X5+180.404X6-44.468X7（R~2=0.989）Y（IL-4含量）=243.535-0.122X1-82.152X3-268.345X5-179.554X6+26.717X7（R~2=0.999）Y（TNF-a含量）=-259.293+0.576X1+237.957X3+688.995X5+785.341X6-96.665X7（R~2=0.961）Y（HE气道病理学评分）=2.060-0.011X1+6.159X3-87.280X5+7.051X6+5.008X7（R~2=0.892）Y（Masson胶原容积分数）=0.837+0.000X1-0.108X3+1.201X5-0.275X6-0.076X7（R~2=0.643）Y（细胞凋亡指数）=447.839+0.221X1+59.082X3+347.453X5+233.587X6-30.580X7（R~2=0.805）Y（EGFR基因表达）=473.334-0.061X1+90.416X3-752.282X5+131.408X6+20.494X7（R~2=0.994）Y（EGFR蛋白表达）=0.168+0.007X1+0.396X3+4.109X5-0.173X6-0.333X7（R~2=0.767）MSD含药肝孵育液中七个成分（E/PE-X1,ME-X2,AM-X3,LQ-X4,L-X5,AG-X6）与气道上皮细胞NaI-NgI组效应指标的相关性分析,自变量X1被系统剔除。Y（细胞凋亡率）=2.595+0.039X2+15.722X3-50.712X4+507.454X5+60.079X6（R2=0.970）Y（EGFRm RNA表达）=2.412+0.003X2-4.360X3+145.501X4+142.059X5-231.981X6（R~2=1.000）Y（EGFR蛋白表达）=0.373-0.00007X2+1.050X3-23.106X4-99.7158X5+46.155X6（R~2=0.817）Y(EGFRAG1478蛋白表达)=0.073-0.001X2+0.0015X3+9.168X4+41.471X5-18.057X6（R~2=1.000）Y（PI3K蛋白表达）=1.166-0.002X2+2.04X3-46.052X4-235.883X5+97.594X6（R~2=0.784）Y（ROS含量）=0.762+0.001X2-0.226X3+5.042X4+70.546X5-17.603X6（R~2=0.861）Y(ROSNAC含量)=0.283+0.004X2+0.796X3-13.415X4-11.015X5+20.272X6（R~2=0.869）Y（TEER）=238.981+0.235X2+32.571X3-2637.947X4+5441.969X5+2797.385X6（R~2=0.935）Y（透过率）=71.369+0.043X2+26.1263X3-162.242X4-6.986X5+367.366X6（R~2=0.647）4.含药肝孵育液和含药血清的差异性成分均有7个,其中含药肝孵育液中缺少ISL;含药肝孵育液中差异性成分的含量高,且不同批次间各成分的RSD值均小于10%。含药肝孵育液组和含药血清组（2.5%）PI3K蛋白表达降低（P＜0.05）,含药肝孵育液和含药血清组AKT蛋白的表达均显著降低（P＜0.05）,除含药肝孵育液2.5%浓度组外,其余各组Caspase-3蛋白表达显著降低（P＜0.05）。且各含药肝孵育液组PI3K、AKT和Caspase-3蛋白的相对表达量RSD值均小于10%。结论:1.含药肝孵育液含量高,稳定性好,与含药血清作用趋势一致且重现性好,用于体外实验有较高的可行性。2.MSD可修复和缓解组胺引发的气道损伤,修复受损的气道屏障,减轻气道重塑;使用特异性抑制剂联合作用后,可以阻断EGFR/PI3K介导的信号转导通路,说明MSD平喘的作用可能与调控EGFR和PI3K的表达有关。3.液质联用检测MSD含药肝孵育液,经比对确定了7个差异性成分,且含量高。在上述平喘的炎症指标中,甘草的主要差异性成分对各效应指标的影响明显强于麻黄和杏仁。