【摘 要】
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目的:肿瘤的发生和进展与其所处的特殊微环境密切相关。巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要免疫细胞,因其具有对环境敏感及可塑性强等特点,常被肿瘤细胞“驯化”,进而促进肿瘤细胞的生存。在课题组前期的研究中,我们发现结直肠癌（colorectal cancer,CRC）组织内部浸润的巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）呈现抗炎的M2极化表型。但TAMs如何被CRC调控,
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目的:肿瘤的发生和进展与其所处的特殊微环境密切相关。巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要免疫细胞,因其具有对环境敏感及可塑性强等特点,常被肿瘤细胞“驯化”,进而促进肿瘤细胞的生存。在课题组前期的研究中,我们发现结直肠癌（colorectal cancer,CRC）组织内部浸润的巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）呈现抗炎的M2极化表型。但TAMs如何被CRC调控,以及其在CRC进展中所发挥的作用尚不清楚。本研究采用多组学数据分析,体内外实验并结合临床样本验证,从外泌体mi RNA角度阐明CRC细胞如何驯化巨噬细胞使其帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸的分子机制,从而为CRC的发生发展提供新的理论依据,并为针对CRC的免疫治疗提供新的策略和思路。方法:利用单细胞测序数据绘制CRC TAMs图谱,揭示不同表型巨噬细胞分子特征。CRC转录组测序数据生存分析结合组织芯片免疫组化（IHC）实验结果,评估CD206+PD-L1+巨噬细胞与CRC患者预后的关系。流式细胞实验检测与CRC细胞共培养后的巨噬细胞是否对CD8+T细胞具有抑制作用。组织芯片IHC实验研究CRC组织中CD206+PD-L1+巨噬细胞与CD8+T细胞浸润之间的相关性。Western blot和q RT-PCR分别检测与CRC细胞共培养后的巨噬细胞中PD-L1表达水平的变化,流式检测其对CD8+T细胞的抑制作用。PKH67标记的外泌体（NCM460-Exo和SW620-Exo）尾静脉注射小鼠,细胞免疫荧光实验、Western blot和q RT-PCR检测腹腔巨噬细胞摄取外泌体后PD-L1水平变化。在巨噬细胞中转染候选mi RNA,再检测细胞中PD-L1水平的变化,进一步筛选出调控巨噬细胞PD-L1的外泌体mi RNA。将过表达mi RNA-21-5p和mi RNA-200a的外泌体（293T-Exo-mi RNA-21-5p和293T-Exo-mi RNA-200a）分别或同时与巨噬细胞共培养,或者利用“RNA海绵”技术在CRC细胞SW620中分别或者同时敲除mi RNA-21-5p和mi RNA-200a,收集3组SW620分泌的外泌体与巨噬细胞共培养,再检测巨噬细胞PD-L1的表达变化,以及其对CD8+T细胞的抑制。生物信息学分析筛选两个mi RNAs调控巨噬细胞PD-L1表达的靶基因;双荧光素酶报告基因实验明确mi RNA与靶基因的结合关系;Western blot研究外泌体mi RNA-21-5p和mi RNA-200a是否可以通过PTEN/AKT和SOCS1/STAT1途径上调巨噬细胞PD-L1表达。动物实验验证外泌体mi RNA-21-5p和mi RNA-200a是否可以通过促进巨噬细胞PD-L1的表达而抑制CD8+T细胞对肿瘤的杀伤作用,进而促进CRC生长。结果:（1）CD206+PD-L1+巨噬细胞浸润水平提示患者预后不良。（2）与CRC细胞共培养增强了巨噬细胞对CD8+T细胞的抑制,并且CRC组织中浸润CD206+PD-L1+巨噬细胞数量与CD8+T细胞数量显著负相关。（3）CRC细胞分泌的外泌体能够显著上调巨噬细胞PD-L1的表达,进而促进巨噬细胞对CD8+T细胞的抑制。（4）动物实验证明,注射入小鼠体内的外泌体能够被其腹腔巨噬细胞高效摄取,并上调巨噬细胞PD-L1的表达。（5）外泌体mi RNA-21-5p和mi R-200a能够上调巨噬细胞PD-L1的表达,并且促进其抑制CD8+T细胞。（6）PTEN和SOCS1是外泌体mi RNA-21-5p和mi R-200a调控巨噬细胞PD-L1表达的靶基因,外泌体mi RNA-21-5p和mi R-200a通过PTEN/AKT和SOCS1/STAT1途径发挥调控PD-L1表达的功能。（7）动物实验证明,小鼠肿瘤组织中巨噬细胞PD-L1表达水平和CD8+T细胞浸润负相关;外泌体mi R-21-5p和mi R-200a能够上调巨噬细胞PD-L1的表达并显著抑制CD8+T细胞在肿瘤中的浸润。结论:CRC来源的外泌体mi RNA-21-5p和mi R-200a可通过PTEN/AKT和SCOC1/STAT1信号途径诱导巨噬细胞高表达PD-L1,促进其抑制CD8+T细胞,帮助CRC细胞实现免疫逃逸。
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