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位于脊髓前角的运动神经元发出轴突参与脊神经的组成,支配躯体骨骼肌运动。当周围神经损伤(peripheral nerve injury,PNI)发生时,脊髓运动神经元的轴突受损甚至断裂。PNI虽然并不会直接影响脊髓内部结构,但有文献提示轴突损伤会导致神经元的树突发生退变,而当轴突完成再生后树突有一定程度的重塑。躯体运动神经传导通路不仅仅依赖于再生轴突重新支配靶区肌组织,大脑上运动神经元发出的轴突将神经信号传递给脊髓运动神经元的树突也发挥至关重要的作用。故PNI后躯体运动功能的修复与脊髓运动神经元树突的结构完整性有密切关系,迄今为止人们只知道PNI损伤与修复过程脊髓运动神经元树突会发生变化,但是其变化规律和影响因素尚不明确。RhoA是小分子Rho GTP酶家族成员,在细胞骨架调控中发挥关键作用。研究显示RhoA在轴突损伤的神经元中被激活,且不利于神经元存活及轴突再生,但其在PNI后树突退变和重塑中的作用尚无相关研究。虽然树突和轴突均是神经元发出的突起,但是有很多研究显示两者退变与再生的调控机制并不一致,所以RhoA对PNI后树突退变与重塑的作用有必要进行深入研究。研究目的:1.以臂丛离断或夹伤为PNI模型,探明PNI后脊髓运动神经元树突的退变与重塑规律;2.利用运动神经元特异性敲除RhoA小鼠模型,揭示RhoA在PNI后脊髓运动神经元树突的退变与重塑过程中发挥的作用。研究方法:1.应用成年C57小鼠,在距椎间孔3mm处制备制备臂丛离断模型。术伤后第7、14、28、56d取材,行微管相关蛋白-2(MAP2)免疫荧光染色和Golgi-Cox染色,通过体视学方法和Sholl分析检测C6-C7节段脊髓前外侧角运动神经元树突的长度与复杂程度。以此评价PNI发生后脊髓运动神经元树突随时间的退变规律。2.应用成年C57小鼠,建立近距离(损伤部位距椎间孔3mm)与远距离(损伤部位距椎间孔10mm)两种臂丛离断模型,在损伤后第14d取材,行MAP2免疫荧光和Golgi-Cox染色后通过体视学方法和Sholl分析检测C6-C7节段脊髓前外侧角运动神经元树突的长度与复杂程度。以此评价不同距离臂丛神经损伤对脊髓运动神经元树突退变的影响。3.应用成年C57小鼠,建立等距离臂丛夹伤模型,在损伤后7、14、28、56d取材,行MAP2免疫荧光和Golgi-Cox染色后通过体视学方法和Sholl分析检测C6-C7节段脊髓前外侧角运动神经元树突的长度与复杂程度。以此评价伴随轴突退变与再生过程,神经元树突的退变与重塑情况。4.利用RhoAflox/flox和HB9Cre小鼠杂交后获得运动神经元特异性RhoA基因敲除(RhoAcKO)小鼠,并利用单纯HB9Cre(Cre)小鼠作为对照鼠,在距椎间孔3mm处制备臂丛离断模型,在损伤后第28d取材进行MAP2免疫荧光染色和Golgi-Cox染色,通过分析树突的密度、长度、复杂程度评估RhoAcKO对脊髓运动神经元树突退变的影响。5.使用RhoA cKO和单纯Cre小鼠,在距椎间孔3mm处制备臂丛神经夹伤模型,术后7、14、28、56d行MAP2免疫荧光染色和Golgi-Cox染色,通过分析树突的密度、长度、复杂程度评估RhoA cKO对脊髓运动神经元树突重塑的影响。研究结果:1.在臂丛离断发生后,脊髓运动神经元树突出现了明显的崩解,MAP2染色结果显示其密度和完整度下降,Golgi-Cox染色结果显示树突的长度指标如最长长度、最大跨度和总长度缩减,结构混乱、排列失去规则,表现为复杂度指标如第一、二、三级的分支数减少。此过程随着时间的进展不断进行,直到损伤后56d其主要结构几乎已经完全消失。2.近距离的臂丛离断比远距离的造成了更大的损伤,MAP2染色显示其脊髓运动神经元树突密度下降,但其完整度损失未见明显的区别。Golgi染色的情况显示,近距离损伤造成的长度指标损失更严重,但复杂度指标损失的情况在两者间没有显著差异。3.在臂丛夹伤后第7-14d,脊髓运动神经元树突结构随着时间崩解加重,到了第56d,脊髓运动神经元树突的总密度、完整度,以及长度和复杂度指标均明显恢复并接近正常状态,提示其在轴突再生树突出现了稳定的重建过程。4.与Cre组相比,臂丛离断后RhoAcKO组脊髓运动神经元树突密度下降和结构损伤的程度更低。5.与Cre组相比,臂丛夹伤后RhoAcKO组脊髓运动神经元树突的修复过程在密度和完整度以及各形态学指标的重塑上都体现出了更高的效率,尤其是术后56d表现更加明显的二级以上即新生分支的延长。研究结论:1.PNI会导致脊髓运动神经元树突的退变,此过程随时间发展逐渐加剧。2.相对远距离损伤,近距离的PNI对脊髓运动神经元树突长度的伤害越大。3.脊髓运动神经元树突在PNI发生后存在着“退变-重塑”的过程,可以重新构建其密度和基本结构,且会刺激新生分支生长。4.在运动神经元特异性敲除RhoA可以减缓PNI后脊髓运动神经元树突的退变并加速神经再生后脊髓运动神经元树突的重塑。