【摘 要】
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大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是奶牛乳腺炎的常见致病菌,严重损害动物福利和奶牛养殖业的经济效益。硒（Selenium,Se）是机体的一种必需微量元素,在抗炎、抗氧化、抗病毒和抗突变等方面发挥作用。在E.coli感染乳腺过程中是否会对自噬产生影响尚未见报道。基于此,本试验通过建立E.coli感染腺泡细胞-T（Mammary alveolar cell-T,MAC-T）的体
【基金项目】
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江苏省农业产业技术体系专项基金（JATS[2021]499）； 江苏省市自然科学基金（BK20211324）； 江苏省333高层次人才培养工程资助项目； 江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）； 江苏高校品牌专业建设工程资助项目（TAPP）；
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大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是奶牛乳腺炎的常见致病菌,严重损害动物福利和奶牛养殖业的经济效益。硒（Selenium,Se）是机体的一种必需微量元素,在抗炎、抗氧化、抗病毒和抗突变等方面发挥作用。在E.coli感染乳腺过程中是否会对自噬产生影响尚未见报道。基于此,本试验通过建立E.coli感染腺泡细胞-T（Mammary alveolar cell-T,MAC-T）的体外模型,探究硒在E.coli感染MAC-T中的作用,重点聚焦是否通过自噬对该菌诱导的炎性反应发挥调控作用,为硒在生产上的应用提供理论依据。1.E.coli感染MAC-T对自噬和NF-κB信号通路激活的影响E.coli以MOI=1:1 感染 MAC-T 0 h、1 h、2 h、3 h 和 4 h,采用 Western Blot 检测NF-κB信号通路和自噬相关蛋白的表达,免疫荧光法观察自噬聚点的变化,qRT-PCR测定相关炎性因子的mRNA相对表达量,同时平板计数法检测E.coli与MAC-T的黏附。结果显示:IκBα磷酸化水平在E.coli感染3h和4h显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;p65的磷酸化水平在2h、3h和4h显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;自噬相关蛋白Atg5在4h极显著升高（P＜0.01）;Beclin1在3h和4h显著升高（P＜0.05）;p62表达差异不显著（P＞0.05）;LC3-Ⅱ在2h、3h和4h极显著下降（P＜0.01）;激光共聚焦显微镜下发现,LC3荧光聚点在感染2 h和4 h时,均显著减少,与蛋白表达相一致;IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达在3 h和4 h极显著增强（P＜0.01）,且具有时间依赖性;E.coli与MAC-T的黏附能力测定发现,E.coli感染MAC-T 2 h、3 h和4 h,黏附于MAC-T的细菌数量显著或极显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。以上结果表明,E.coli感染MAC-T细胞抑制了自噬,同时激活NF-κB介导的炎性反应。2.自噬对E.coli诱导NF-κB信号通路转导引发炎性反应的影响为进一步探究自噬对NF-κB介导炎性反应的调节作用,采用自噬调控剂进行干预,探讨自噬对E.coli感染细胞诱导的NF-κB通路相关蛋白、炎性因子mRNA的表达以及E.coli与MAC-T黏附的变化。结果显示:雷帕霉素干预后,LC3-Ⅱ表达显著降低（P＜0.01）;p62变化水平不显著（P＞0.05）;IκBα和p65的磷酸化水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）);IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）;细菌于MAC-T的黏附减弱。3-MA干预后,LC3-Ⅱ进一步减少（P＜0.01）;p62蛋白水平升高（P＜0.05）;IκBα和p65的磷酸化水平显著上升（P＜0.05）;IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α的 mRNA 转录进一步增强（P＜0.05或P＜0.01）;E.coli与MAC-T的黏附增强。CQ干预后,LC3-Ⅱ和p62蛋白表达水平均极显著升高（P＜0.01）;p65和IκBα的磷酸化进一步增强（P＜0.01）;IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录也显著增强（P＜0.05或P＜0.01）;E.coli与MAC-T的黏附显著增强。因此,增强自噬可缓解E.coli诱导的NF-κB介导的炎性反应,抑制自噬则进一步加剧炎性反应。3.基于自噬研究硒对E.coli诱导NF-κB信号通路转导引发炎症的影响为探究自噬是否参与硒对炎性反应的调控,采用硒代蛋氨酸（Selenium methionine,Se-Met）预处理细胞12 h,并用CQ预处理2 h后,建立感染进行相关检测。结果发现:与E.coli组相比,硒可显著促进LC3-Ⅱ表达（P＜0.01）,且p62表达差异不显著（P＞0.05）,说明硒可以增强自噬。当采用CQ抑制自噬体与溶酶体结合后,LC3-Ⅱ和p62表达极显著增强（P＜0.01）,自噬流阻滞。同时,硒干预后,IκBα和 p65 的磷酸化水平降低（P＜0.01）,IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α的 mRNA 转录被抑制（P＜0.05）,同时极显著抑制了E.coli与MAC-T的黏附（P＜0.01）,说明硒能够增强自噬,抑制NF-κB信号通路的转导,降低相关炎性反应。而当CQ抑制自噬流时,明显激活NF-κB信号通路的转导及其下游相关炎性因子转录:IκBα和p65的磷酸化水平升高（P＜0.05）,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录显著或极显著增强（P＜0.05或P＜0.01）,且细菌与细胞的黏附也极显著增强（P＜0.01）。故硒可通过增强自噬并保持自噬流的通畅抑制E.coli诱导的NF-κB介导的炎性反应。E.coli可诱导MAC-T炎性反应并通过抑制自噬小体的形成抑制自噬,而硒可通过增强自噬抑制NF-κB介导的炎性反应和E.coli与MAC-T的黏附。
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