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β-内酰胺类抗生素是应用广泛的一类抗生素,在预防和治疗动物疾病中发挥重要的作用。但该类抗生素的不合理使用或滥用,会造成动物源性食品中抗生素的残留,危害了食品安全和人类健康。因此快速、简便、灵敏的抗生素残留筛选方法是保障食品安全的重要手段,目前常用的抗生素残留筛选方法包括微生物法、理化分析法、免疫分析法以及受体分析法。受体分析法具有操作简便、检测限低、成本低等优点,且青霉素结合蛋白能够识别β-内酰胺类抗生素,在受体分析法中应用广泛。BlaR-CTD蛋白对头孢氨苄的亲和力较差,且蛋白稳定性较差,利用定点突变技术对蛋白进行定向改造,可以有目的地考察蛋白结构、功能及活性。本研究基于地衣芽孢杆菌ATCC14580的BlaR-CTD蛋白进行结构改造,筛选出对β-内酰胺类抗生素亲和力高且稳定性好的突变蛋白,建立基质样品中β-内酰胺类抗生素残留筛选的受体分析法。1突变位点的选择及突变质粒的获得本研究将氨基酸的定点突变作为蛋白结构改造的手段。通过同源模建得到BlaR-CTD蛋白的3D结构,利用Sybel 2.0将BlaR-CTD蛋白与β-内酰胺类抗生素进行分子对接,得到参与蛋白与药物结合中氢键形成的的关键氨基酸位点。为了提高蛋白的亲和力,通过蛋白序列比对,选择与头孢羟氨苄亲和力较好的PBP3蛋白中的主要结合氨基酸位点,得到突变位点V197D。另外根据Polyphen 2和SIFT软件进行突变预测,结合分子对接得到的关键氨基酸位点,选择距离活性中心5（?）范围内、且避开药物与蛋白结合关键氨基酸的突变位点A138E、Q147K、S190Y。为了提高蛋白的稳定性,在蛋白柔性区插入盐桥或二硫键,分析蛋白结构,突变位点I188K可与β6片段中的Glu212形成盐桥。根据软件Disulfide by Design 2.0来预测二硫键可以插入的位点,根据成键能量较小、温度因子较大的原则选择距离BlaR-CTD蛋白活性中心较远的柔性区突变位点S76C/L96C、S135C/S145C、R50C/Q147C、S19C/G24C、E183C/I188C。在后续研究中,为了同时提高蛋白的亲和力和稳定性,结合已有蛋白的活性,将突变进行结合得到叠加效应。根据突变位点设计突变引物,以pET-28a（+）-BlaR-CTD质粒为模板,在高保真DNA聚合酶的作用下进行一步法PCR,产物进行琼脂糖凝胶电泳验证后,用DpnⅠ酶消除模板质粒,反应产物进行转化后并提取突变质粒。2突变蛋白的诱导表达及纯化将突变质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后进行诱导表达和纯化,验证并优化诱导时间、诱导温度、诱导剂的浓度及蛋白纯化时咪唑的最佳洗脱浓度。结果表明,蛋白的最佳诱导条件是IPTG的终浓度为1 m M,诱导温度为18℃,诱导时间为12 h,对得到的蛋白产物进行亲和层析纯化,突变蛋白在咪唑浓度为60、100、200m M时洗脱下来,收集洗脱液后进行PBS透析,透析后得到的蛋白浓度为1.3 mg·m L-1,为后续研究提供足够的蛋白。3受体分析法的建立通过比较突变蛋白的活性,选择识别药物种类多且亲和力好的突变蛋白I188K/S19C/G24C作为研究对象,优化受体分析法中蛋白及酶标记药物的工作浓度、包被液、封闭液、封闭条件、反应时间、反应温度、离子浓度、p H等反应条件,并建立β-内酰胺类抗生素残留筛选的受体分析法。用磷酸盐缓冲液（PBS,p H7.4）稀释突变蛋白I188K/S19C/G24C,包被于酶标板条,4℃包被12 h,以牛血清白蛋白（BSA）为封闭缓冲液,4℃封闭12 h,加入β-内酰胺类抗生素和酶标记药物HRP-AMP后,30℃反应30 min,加入底物显色液在37℃反应15 min,加入终止液并测定OD450。结果表明,优化后的反应条件下药物抑制率最好且蛋白和酶标记药物用量较少,蛋白的包被浓度为1μg·m L-1,HRP-AMP的浓度为0.36μg·L-1。按照已优化的受体分析法建立头孢喹肟的标准曲线,回归方程为y=-0.4547x+0.7687,相关系数r=0.9997,IC50值为3.90±0.11μg·L-1（n=5）,其线性范围为0.5-8μg·L-1,检测限为0.73μg·L-1,板间和板内变异系数均小于10%。且突变蛋白I188K/S19C/G24C可以识别40种β-内酰胺类抗生素,IC50值为0.05-894μg·L-1。4受体分析法的应用在牛奶、猪肉、鸡肉、牛肉样品中的最低检测限为0.03-394.13μg·L-1,最低定量限为0.07-925.13μg·L-1,按1×LOQ、2×LOQ、4×LOQ分别向空白的牛奶、猪肉、鸡肉、牛肉样品中添加β-内酰胺类抗生素,牛奶样品中的回收率为63.02%-110.32%,批内和批间变异系数均小于16%,猪肉样品中的回收率为60.87%-112.32%,批内和批间变异系数均小于15%,鸡肉样品中的回收率为51.77%-113.94%,批内和批间变异系数均小于15%,牛肉样品中的回收率为63.46%-119.77%,批内和批间变异系数均小于15%。对突变蛋白、标准品、酶标记药物进行6个月的长期稳定性试验,结果表明突变蛋白I188K/S19C/G24C直接储存于-20℃能长期保持活性,密封储存于酶标板时在-20℃和4℃能长期保持活性;头孢喹肟标准品和酶标记药物储存于-20℃能长期保持其活性。综上所述,本研究通过同源模建、分子对接、软件模拟后设计并得到23个突变体,经过活性鉴定后筛选出识别药物种类多、亲和力最好的突变蛋白I188K/S19C/G24C,且该突变蛋白稳定性最好,建立以突变蛋白I188K/S19C/G24C为受体蛋白的受体分析法。该方法快速、操作简便、灵敏,且样品前处理简单,能够同时检测40种β-内酰胺类抗生素,其中35种β-内酰胺类抗生素在牛奶、猪肉、鸡肉、牛肉组织中的最低检测限低于欧盟最大残留限量规定。