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c-Abl是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl在细胞内的同源基因,所编码的蛋白c-Abl属于非受体酪氨酸激酶,在细胞核和细胞质中广泛分布,具有重要的生物学功能。c-Abl通过与其底物相互作用,并使其相互作用蛋白酪氨酸磷酸化而激活一系列重要的信号转导途径,参与调控细胞黏附迁移、细胞增殖与分化、细胞转化、细胞周期和细胞凋亡、基因转录等过程。c-Abl在DNA损伤应激反应中具有重要的调节作用;c-Abl在RNA转录后加工过程中也发挥着重要的调节作用。至今,c-Abl具体的下游因子及分子机制知之甚少。 为进一步研究c-Abl发挥功能的分子机理,实验室前期以全长c-Abl为诱饵蛋白,采用酵母双杂交法筛选Hela细胞cDNA库,获得一系列与c-Abl相互作用的靶分子,发现剪接因子U2AF65(U2 snRNP auxiliary factor65kDa subunit)可能与c-Abl相互作用。U2AF65作为重要的mRNA剪接因子,它与前体mRNA内含子多聚嘧啶区的特异结合是起始剪接体组装的关键步骤,同时它也参与可变剪接的调节和mRNA核-质转运。U2AF65的RS结构域与前体mRNA内含子分支位点BPS交叉连接,使U2snRNP中的snRNA更容易与BPS结合;该结构域也作为核定位信号,在亚细胞定位和核质穿梭中起到重要的决定作用。RRM结构域识别pre-mRNA内含子中主要由尿嘧啶组成的多聚嘧啶序列Py-tract。UHM结构域介导蛋白质之间相互作用。U2AF65的Lys15和Lys276可以发生酰羟基化并影响U2AF65的活性,进而引发某些基因的可变剪接。至今,有关U2AF65调控的研究甚少。 本论文在酵母双杂交实验的基础上,对非受体酪氨酸激酶c-Abl与U2AF65相互作用及其在核质穿梭、mRNA转运,可变剪接等过程中的作用进行了研究。 本研究通过免疫沉淀、免疫印迹及GST-pull down方法证明c-Abl和U2AF65在细胞内和细胞外直接相互作用。c-Abl通过SH2、SH3结构域与U2AF65直接结合。通过GST-pull down和点突变的方法发现与c-Abl结合的结构域是UHM结构域,参与结合的氨基酸残基主要包括第414、416和423位脯氨酸。通过抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹实验证明c-Abl可以使U2AF65酪氨酸磷酸化,U2AF65是非受体酪氨酸激酶c-Abl的磷酸化底物,但是磷酸化较弱;利用质谱分析发现U2AF65可能的磷酸化位点是第91位和第232位酪氨酸。进一步的研究发现c-Abl基本不影响U2AF65的表达。U2AF65是核质穿梭蛋白,但通常在荧光显微镜下它只在细胞核中被观察到。用5、10、15Gy剂量电离辐射处理细胞,DNA损伤应激条件下,U2AF65由细胞核向细胞质转移,转移的程度具有剂量依赖性。随着时间的推移,U2AF65又由细胞质向细胞核转位。当用c-Abl抑制剂STI571处理细胞,无论是出核还是之后的入核都被抑制。当使用缺失c-Abl激酶活性的MCF-7(c-Abl K290R)细胞,发现U2AF65更多地定位在细胞质中,以15Gy剂量的电离辐射处理之后,也没有出现核质之间的转移,说明U2AF65在细胞内的分布和c-Abl的活性相关。c-Abl调控电离辐射介导的U2AF65的核质间的穿梭。核质之间的穿梭通常与蛋白的核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)有关,CRM1,即exportin1,是主要的出核介导物。它与出核蛋白上的NES序列结合并将其转运至核孔的出核部分。Leptomycin B(LMB)可特异阻断CRM1识别NES信号从而阻断蛋白质核输出过程。我们发现,15Gy剂量辐射处理细胞的同时再加LMB处理2h,U2AF65没有完全从细胞核转移入细胞质,部分滞留在细胞核。说明U2AF65蛋白自身可能含有NES信号。经过对U2AF65氨基酸序列的分析,在U2AF65的RRM2结构域和UHM结构域之间,发现一段疑似NES的特征性序列374-LCLMNMVLP-382。瞬间异核体形成实验证明U2AF65的NES介导其出核。同时发现,电离辐射可调控U2AF65介导的mRNA转运,在细胞接受电离辐射不同时间(2h、4h)后,细胞质中HEXIM和ZNF174基因的mRNA(其核-质转运由 U2AF65介导)水平均升高。由于而这两个基因编码的蛋白质是转录抑制因子,说明c-Abl可能通过调控这类转录因子的核-质转运调控基因转录。 最后,我们通过Affymetrix外显子芯片,发现c-Abl广泛参与的转录和剪接调控。由Partek软件分析输出差异表达基因列表,和可能发生可变剪接的基因和位点,大量基因发生了受调控的可变剪接。 本研究通过c-Abl与U2AF65的相互作用及生物学意义研究得到如下结果: c-Abl能够直接与U2AF65相互作用;c-Abl与U2AF65UHM结构域的第414-423位氨基酸残基结合;c-Abl能够使U2AF65磷酸化,酪氨酸磷酸化位点分析表明U2AF65的Y91和Y232可能是磷酸化位点;c-Abl基本不影响U2AF65的表达;U2AF65是核质间穿梭蛋白,其核-质穿梭受c-Abl依赖的电离辐射调控;U2AF65具有NES核输出信号,特征性序列为LCLMNMVLP;电离辐射调控U2AF65介导的mRNA转运;c-Abl广泛调控基因转录和可变剪接。 通过c-Abl与U2AF65的相互作用及其生物学意义的研究,证明c-Abl非受体酪氨酸激酶与剪接因子U2AF65存在相互作用,并对c-Abl酪氨酸激酶调节U2AF65的核质穿梭和mRNA转运,c-Abl参与调控转录和可变剪接的机制进行了探讨。对深入认识c-Abl酪氨酸激酶在生理条件下和应激条件下的功能具有重要的理论意义。