前言经皮腔内冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention,PCI）是目前国内外广泛应用的治疗冠心病有效手段,但PCI术后半年内再狭窄（restenosis,RS）率高达10%--30%,严重影响其远期疗效。没有药物治疗方法证明可以有效防治再狭窄,即使采用血管内放射疗法及药物涂层支架等特殊疗法,再狭窄率仍为8-9%。因此防治PCI术后RS已成为冠状动脉介入治疗急待解决的热点课题。近年来随着分子生物学的发展,基因治疗很可能成为防治PCI术后RS的一种新策略。Egr-1是一种锌指结构转录因子和DNA黏附蛋白,在正常血管壁中低水平表达或不表达,而在动脉损伤和其它多种刺激下可诱导血管平滑肌细胞（vascularsmooth muscle cell,VSMC）及内皮细胞表达,其调控着多种与细胞增殖相关基因的表达,诱导VSMC的分裂、增殖和内膜增生。诱骗性寡脱氧核苷酸（decoyoligodeoxynucleotide,Decoy ODN）是一种顺式作用元件,与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似,在与转录因子与内源顺式DNA序列元件竞争,诱骗转录因子与它结合,下调转录因子所调控的基因表达。Decoy ODN作为一种新型的基因抑制剂在病理生理方面具有实际意义。本研究设计了大鼠Egr-1mRNA的诱骗性寡脱氧核苷酸,作用于损伤后的颈总动脉内膜,观察其对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的抑制作用,并初步探讨其作用机制。实验材料和方法1、实验材料健康雄性Wistar大白鼠96只,体重350～400g,由中国医科大学实验动物中心提供;2F Fogarty导管购自美国Baxter healthcare corporation;转染试剂FuGENE6购自Roche公司;Egr-1兔抗大鼠单克隆抗体购自Santa cruz公司;bFGF羊抗大鼠单克隆抗体（购自博士德生物有限公司）;IGF-1兔抗大鼠多克隆抗体（购自博士德生物有限公司）;Decoy ODN由上海博亚生物技术有限公司合成;RNAout提取试剂盒购自深圳市华氏生物技术有限公司,RT-PCR逆转录试剂盒购自TaKaRa公司;一氧化氮（nitric oxide,NO）检测试剂盒和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）检测试剂盒购于南京聚力生物医学工程研究所;内皮素（endothelium,ET）分析试剂盒购于北京东亚免疫技术研究所。2、针对Egr-1 mRNA的Decoy ODN的合成Decoy ODN由上海博亚生物技术有限公司合成,egr-1 Decoy ODN的基因序列为:5′_TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG₃′对合5′_CCCTTAGCGGGGGCGAGGGCGA₃′。对照基因的序列5′_AGCCGCACCGGCCTGCCTCGTC₃′对合5′_GACGAGGCAGGCCGGTGCGGCT₃′。在其3′和5′端进行硫代修饰,5′端用FITC标记,以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。3、实验动物分组96只雄性Wistar大白鼠随机分为4组,每组24只。治疗组（Decoy ODN+FuGene 6+MgCl₂）:球囊拉伤左颈总动脉后,应用微量注射器局部释放200μl含有500μg FITC标记的Decoy ODN、30μl转染试剂FuGene 6的1mM Mgcl₂溶液,使其在局部作用20分钟。对照（FuGene 6+MgCl₂）组:球囊拉伤左颈总动脉后局部注入200μl含30μl FuGene 6转染试剂的1 mM MgCL₂液。对照治疗组（对照基因+FuGene 6+MgCl₂）:球囊拉伤左颈总动脉后,应用微量注射器局部释放200μl含有500μg FITC标记的对照Decoy ODN、30μl转染试剂FuGene 6的1mMMgcl₂溶液,使其在局部作用20分钟。假手术组:只进行颈动脉结扎,但不插入导管,即不造成动脉内膜损伤。而对照组分别为稀释液和转染液而设计的对照。并于术后3、7、14、21天分别处死各组动物6只,处死前心脏采血备用。4、动脉损伤模型的建立和Decoy ODN治疗基因的在体转染10%水合氯醛腹腔注射（30mg/kg）麻醉后,颈正中切开,钝性分离左颈动脉,血管夹暂时阻断左颈总动脉近心、远心端血流,用2F导管从颈外动脉插入左颈总动脉内,推入0.2ml生理盐水充盈气囊,反复抽拉球囊三次,造成左颈总动脉内膜损伤。应用微量注射器将含有FITC标记的Decoy ODN局部注入至损伤的血管节段内,使其在局部作用20分钟。术后结扎颈外动脉,恢复血流,缝合颈部创口。使用青霉素预防感染,喂食标准饲料,自由饮水。术后24h处死2只动物,取治疗部位的血管放于液氮中,制成冰冻切片,HE染色光镜下观察内皮剥脱情况,荧光显微镜下观察FITC-Decoy ODN转染情况。5、取材与血管标本制作手术后不同时间点,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后动物后,无菌条件下游离左颈总动脉,血管夹暂时阻断左颈总动脉近心、远心端血流,迅速取下血管,用肝素盐水冲洗血管,部分血管用10%中性甲醛固定用于病理学检查,另一部分迅速放入液氮冷冻,-70℃保存,用于总RNA的提取和组织蛋白的检测。6、NO、NOS水平和ET浓度的测定大鼠处死前心脏取动脉血4ml注入无抗凝剂和有抗凝剂试管中,离心后取血清及血浆备检。血清NO、NOS的测定:用硝酸还原酶法,按NO检测试剂盒说明书进行操作。血清NOS的测定:采用化学比色法,按NOS检测试剂盒说明书进行操作。血浆ET浓度测定:用放射免疫分析法测定血浆ET浓度,操作按分析试剂盒操作说明书进行。7、血管标本的病理学检查石蜡包埋,从每段血管的横截面随机切下3张切片（片厚5μm）,HE染色,光镜显微镜下观察血管内膜增生情况,并应用计算机图像分析软件进行图象分析,每个标本间隔取3张切片,测定内膜和中膜厚度,并计算狭窄率。狭窄率（stenosis%）=内膜面积×100/（内膜面积+管腔面积）,图象分析由操作熟练但不知情者操作。同时取病变血管2mm,生理盐水冲洗后,用2.5%的戊二醛固定后,用透射电镜检查,观察血管平滑肌细胞的超微结构变化。8、免疫组织化学染色采用辣根过氧化酶标记的链霉卵白素染色（SP）法进行Egr-1,bFGF,IGF-1的免疫组织化学染色,以磷酸缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。阳性细胞为胞核内有颗粒状棕黄色着色。每个标本选取4个切片,每张切片随机选取6个不同视野,在400倍光镜下计数阳性细胞的百分比,计算平均值。9、血管组织Egr-1,bFGF,IGF-1蛋白含量的测定采用Western-blot方法。每两个血管样本为一组,剪碎后加入预冷裂解缓冲液500μl,冰上匀浆,之后4℃12000g离心12分钟,上清即为总蛋白。吸取上清,紫外分光光度计测量组织总蛋白浓度后,分装,-70℃保存。配制聚丙烯酰胺凝胶,样本置于沸水浴中5分钟使蛋白变性,每孔加样20μl,聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,脱脂奶粉封闭2h,加入稀释的Egr-1（1:300）,PCNA（1:300）和TGF-β₁（1:300）一抗,4℃孵育过夜。洗膜液洗3次,加入稀释的辣根过氧化酶标记的二抗孵育1h,洗膜液洗3次,每次10分钟,显色2-5分钟,待蛋白条带显示清晰时,中止反应,扫描,记录结果。10、血管组织Egr-1,bFGF,IGF-1 mRNA含量的测定采用RT-PCR方法。应用RNAout一步法提取血管组织总RNA。取血管组织1mg（两根血管为一组）,加入RNAout.1ml,之后剪碎、吹打、混匀,置于室温2小时,再经氯仿、异丙醇提取总RNA。紫外分光光度计测量A_260nm/280nm比值,如在1.8-2.1之间,说明RNA无降解。-70℃保存产物。取各组总RNA3μg逆转录合成cDNA,逆转录反应根据逆转录试剂盒要求的标准进行,反应条件为:30℃10min,45℃30min,99℃5min,5℃10min。PCR中Egr-1、bFGF、IGF-1的引物和内参照βactin的引物由TaKaRa公司设计并合成。Egr-1上游5′-CAGTCGTAGTGACCACCTTACCA-3′,下游;5′-AGGTTGCTGTCATGTCTGAAAGAC-3′;bFGF上游:5′-TCGTTTCAGTGCCACATACCA-3′,下游:5′-GGGAGAAGAGCGACCCACA-3′。IGF-1上游:5′-TTGTTTCCTGCACTTCCTCTACTT-3′,下游:5,-CCCTTTGCGGGGCTGA-3′。GAPDH上游为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′下游为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′;β-actin上游:5′-GTGGGCCGCTCAAGGCACCAA-3′,下游:5′-CTTTAGCACGCACTGTAGTTTCTC-3′。扩增片段分别为bFGF 231bp,Egr-1 449bp,IGF-1 bp281 bp,GAPDH,452bp,β-actin 400 bp。1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量均为10μl,溴化乙锭染色,结果用凝胶成像分析仪进行分析,RT-PCR扩增的片段长度与预期的相符,将每份标本的Egr-1、bFGF和IGF-1扩增条带与内参照GAPDH扩增条带的灰度值比作为Egr-1、bFGF和IGF-1含量的相对值。实验结果1、在体转染效果观察转染治疗基因24小时后,取治疗局部血管的冰冻切片置于荧光显微镜下观察,可见残存血管内膜及中膜有大量绿色荧光分布,证明转染成功。2、血清NO、NOS及血浆ET测定结果球囊损伤大鼠颈总动脉后3、7、14、21天,治疗组血清NOS含量较两对照组高,且高于假手术组。治疗组血清NO含量较两对照组高,但较假手术组明显降低。治疗组血浆内皮素浓度较两对照组低,治疗组和两对照组血浆内皮素浓度较假手术组高,21天治疗组及两对照组血浆内皮素浓度已开始降低。3、病理学检查结果大鼠颈总动脉拉伤后,可见内皮剥脱,说明球囊拉伤动脉模型成功;在假手术组,血管内膜由一层完整的内皮细胞覆盖,无内膜增生;在对照治疗组和对照组7天时可见内膜增生,14天、21天时内膜增生更明显,内膜及中膜层有大量的增生细胞,排列紊乱,内弹力板模糊,两组比较差异无显著性。治疗组与同一时间点对照治疗组和对照组相比,内膜增生受到抑制,两者之间差异有显著性（P<0.01）。透射电镜下观察:正常颈动脉血管平滑肌细胞（SMC）呈收缩型,核呈梭形,胞质含大量肌丝,在核两端有少量线粒体;血管损伤后SMC胞体肥大,核明显增大,胞浆内线粒体、高尔基体等增多,而肌丝含量减少,呈合成型;治疗组的SMC胞体及核较小,胞浆内肌丝含量相对较多,线粒体、高尔基体亦较少,接近收缩型的SMC。4、免疫组化结果正常动脉未见bFGF表达,IGF-1及Egr-1呈微量表达;动脉损伤后14天,新生内膜及中膜中bFGF阳性表达达到高峰,14天后逐渐下降;IGF-1阳性表达14天达到高峰;Egr-1呈持续高表达。经Decoy ODN作用后,动脉中bFGF、IGF-1及Egr-1表达减少,与对照组和对照治疗组比较差异有显著性（P<0.001）。5、血管壁组织的Egr-1、bFGF和IGF-1蛋白表达Egr-1是一分子量为80Kda的蛋白质。在假手术组,Egr-1无蛋白条带;球囊损伤后3天有微弱的蛋白条带;7、14、21天Egr-1的蛋白条带灰度明显增加;治疗组各时间点蛋白条带灰度较对照组和对照治疗组减弱（p<0.05）。bFGF是一分子量36kDa的蛋白质。在假手术组,bFGF无蛋白条带;球囊损伤后3、7、14、21天bFGF蛋白条带灰度增加,以14天最为明显;治疗组各时间点蛋白条带灰度较对照组和对照治疗组减弱（p<0.05）;IGF-1 25kDa的蛋白质,球囊损伤后IGF-1蛋白条带灰度增加,14天最为明显;治疗组各时间点蛋白条带灰度较对照组和对照治疗组减弱（p<0.05）。6、血管壁组织的Egr-1、bFGF和IGF-1 mRNA表达假手术组大鼠动脉有Egr-1、IGF-1 mRNA的微弱表达,无bFGF mRNA表达;球囊损伤后Egr-1、bFGF和IGF-1mRNA明显增加。Egr-1mRNA呈持续而明显的增高;bFGF mRNA表达以14天时最为明显,14天后开始降低。IGF-1 mRNA以14天时最为明显,14天后开始降低。经Decoy ODN治疗后在各个时间点Egr-1、bFGF、IGF-1 mRNA表达减少,与对照组和对照治疗组比较有显著差异（p<0.05）。讨论PCI术是目前解决缺血心肌再灌注的主要措施,但导管在血管内的操作将不可避免地造成内皮的损伤,内皮损伤后,各种转录调节基因随之激活（如:Egr-1）,平滑肌细胞开始增殖并分泌细胞外基质,形成增厚的新生内膜。阻断这些转录调节基因的表达,以抑制平滑肌细胞的增殖,减轻内膜的增生,以达到阻止再狭窄的目的。我们选择Egr-1作为干预再狭窄治疗的理想靶点是因为（1）Egr-1在正常的动脉中表达很低或不表达,但机械损伤后快速上调其表达。（2）Egr-1被多种能促进介入后再狭窄和动脉硬化再狭窄的刺激所激活。（3）Egr-1作为重要的核转录因子之一,偶联细胞外刺激与细胞内信号转导,介导多种下游基因的表达,故通过调节Egr-1可以控制一批相关基因的表达,可能比抑制单个细胞增殖基因的治疗方法更有效。Egr-1控制着许多与形成血管狭窄有关的基因的表达,这些因子诱导VSMC的增生和迁移,如:血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子β1（TGFβ1）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor bFGF）和胰岛素样生长因子-1（Insulin-likegrowthfacter-1 IGF-1）等。而诱骗性寡脱氧核苷酸是一种顺式作用元件,与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似,在与转录因子与内源顺式DNA序列元件竞争,诱骗转录因子与它结合,下调转录因子所调控的基因表达。而且它有明显的优势:性质相对稳定,在生理PH值、温度和离子条件下,其稳定性较高;结构简单,对底物的趋近性相对好。因此本研究设计了针对大鼠Egr-1的Decoy ODN,作用于损伤后的动脉内膜,观察其治疗其治疗效果。正常状态下,血管内皮细胞以完整连续的单层构成血液与动脉细胞之间的机械屏障,防止血液中损伤因素直接作用于中层平滑肌细胞,同时内皮细胞释放多种生长抑制因子,维护中膜血管平滑肌细胞（VSMC）处于安静状态,抑制VSMC增殖。内皮细胞损伤后,内皮细胞与平滑肌细胞之间的平衡被破坏,损伤的内皮细胞和平滑肌细胞释放大量的活性物质,引起VSMC增殖,新生内膜形成。NO、NOS和ET均是反映内皮分泌作用的重要指标,对血管舒缩的调节起到关键作用,其浓度的高低与PCI术后再狭窄有密切关系。NO是一种具有多种生物学活性的细胞因子。NOS是NO合成的限速酶,在NOS的作用下,体内的左旋精氨酸和分子氧发生反应,脱去左旋胍氨酸而释放NO。ET是迄今为止体内最强的缩血管活性肽,同时具有较强的生长因子样活性,通过自分泌或旁分泌方式促进血管平滑肌细胞增生。有研究发现血管内皮细胞损伤后造成NOS的大量破坏,NO合成减少,同样血管内皮细胞损伤后造成ET释放增加。实验发现,应用ED5治疗后可以减少血管损伤后的ET释放,但由于血管内膜损伤后仍释放大量ET,因此仍较正常组增高,而且新生内膜也分泌ET,刺激平滑肌增生。实验亦发现Decoy ODN可以增加血管损伤后NO和NOS的释放量,NO与NOS的增加一致,与NOS催化L-精氨酸合成释放NO的观点一致;而血管损伤后治疗组及对照组NOS的释放量均高于假手术组,考虑是血管损伤后为维持损伤血管的张力及减少血栓形成的一种代偿机制。因此,Decoy ODN对血管内皮细胞功能的影响是Decoy ODN通过抑制Egr-1的合成,间接发挥改善血管内皮细胞功能的作用。已证实SMC的增生和迁移在血管损伤后再狭窄中起着重要的作用。本研究的结果也发现血管损伤后有不同程度的内膜增厚,官腔变窄;透射电镜发现正常颈动脉血管SMC呈收缩型,核呈梭形,胞质含大量肌丝,在核两端有少量线粒体;血管损伤后SMC胞体肥大,核明显增大,胞浆内线粒体、高尔基体等增多,而肌丝含量减少,呈合成型;Decoy ODN治疗组的SMC胞体及核较小,胞浆内肌丝含量相对较多,线粒体、高尔基体亦较少,接近收缩型的SMC。表明Decoy ODN通过抑制Egr-1的表达,调控VSMC的表型变化,从而抑制VSMC的过度增殖和内膜增生,因此减轻了血管损伤后的内膜增生程度。bFGF具有促细胞增殖的活性,同时也加快创伤愈合的过程。IGF-1在体内外能促进多种细胞的生长和分化,是细胞生长的重要调节因子,在促进细胞DNA、RNA和蛋白质合成,提高氨基酸转运,脂肪合成,糖的氧化和糖原合成等方面具有综合效应。目前已经明确IGF-1启动子中含有两个富含GC的Egr-1的结合位点,活化的Egr-1可通过与这些位点的直接结合而调控其表达,此外,表达的IGF-1本身又可作为刺激原激活核转录因子Egr-1,从而形成一个级联放大的正反馈环,故IGF-1在细胞增殖中起关键作用。本研究结果表明,正常的血管壁有bFGF微量表达,血管损伤后bFGF的表达上调,14天达高峰,Decoy ODN治疗后其表达减少。因此表明Decoy ODN—这种新型的RNA水平上的强效基因灭火因子,通过抑制Egr-1的表达,在某种程度上也抑制了bFGF的转录和表达,来抑制动脉损伤后新生内膜的增生。本研究亦发现大鼠球囊血管损伤后IGF-1的高表达,14天最明显。Decoy ODN治疗后IGF-1的表达下降这可能与Egr-1控制IGF-1基因的表达有关。既往在基因治疗再狭窄上的主要难点是,寡核苷酸在进入细胞核之前,大部分已被溶酶体降解或随血流扩散,为提高治疗效果,使Decoy ODN在细胞内发挥作用,必须使其从细胞外高效转染至细胞内,与靶基因的mRNA结合。现在比较好的转运方法是通过阳离子脂质体转染,我们采用阳离子脂质体FuGene6提高了转染效率,并对Decoy ODN两端进行了硫代修饰,使其在细胞核内长期稳定存在,防止核酸酶的降解,通过直接经血管腔内转基因方法将Decoy ODN转染到损伤的血管节段。本研究设计了针对大鼠Egr-1mRNA的Decoy ODN,作用于损伤后的动脉内膜,结果发现血清NO、NOS的水平增高,ET浓度降低;Egr-1、IGF-1及bFGF的表达下降,内膜增生程度减轻,提示Decoy ODN可能是通过保护血管内皮细胞功能,影响VSMC的表型改变,抑制其相应基因Egr-1、IGF-1、bFGF的转录和表达而阻遏动脉损伤后的内膜增生。结论1 Decoy ODN可能是通过降低ET分泌量,增加NO及NOS的含量,从而间接发挥改善血管内皮功能的作用,达到减轻新生内膜厚度,预防再狭窄的目的。2 Decoy ODN可能是通过影响血管平滑肌细胞表型的改变来减轻动脉损伤新生内膜的增生,从而预防再狭窄。3 Decoy ODN可能是通过特异性抑制其相应基因的表达来阻遏动脉损伤后的内膜增生。