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目的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是免疫介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病,发病机制未明。目前尚没有针对病因的防治措施,病情迁延容易进展为肝硬化。巨噬细胞在维持肝组织免疫炎症和耐受平衡中起关键作用。受体相互作用蛋白3(receptor interaction protein 3,RIP3)是调控细胞凋亡和坏死的关键分子开关。已有研究揭示RIP3介导的程序性坏死通路是调控巨噬细胞功能的关键通路,然而AIH患者肝脏巨噬细胞RIP3信号活化状态及免疫功能未知。本研究旨在探究RIP3信号在AIH患者和刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)诱导的免疫性肝炎小鼠肝脏中的活化表达情况和对局部免疫调控的影响,以期为临床防治提供新线索。方法1.收集12例于2017年12月至2018年6月在天津医科大学总医院消化科行肝穿刺病理检查的AIH患者,6例年龄、性别匹配的无肝功能异常的肝囊肿患者为对照,收集肝组织,使用免疫荧光检测肝组织p-RIP3和p-MLKL的表达并与巨噬细胞共定位,使用RT-q PCR检测肝组织RIP3和MLKL m RNA表达水平。2.选用6周龄雌性C57BL/6小鼠,利用尾静脉注射Con A建立AIH急性动物模型,Con A注射12小时后麻醉下摘眼球取血并予小鼠安乐死。分别使用RIP3抑制剂GSK872和糖皮质激素地塞米松(DEX)进行治疗干预。应用RT-q PCR分析肝组织RIP3、MLKL、细胞因子和趋化因子的表达水平。使用流式细胞术分析小鼠肝、脾、外周血骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的比例。3.使用Raw264.7细胞系进行巨噬细胞体外研究。使用3ug/ml脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞,应用RT-q PCR法检测RIP3信号对巨噬细胞细胞因子和趋化因子表达的影响。结果1.AIH患者肝组织内p-RIP3和p-MLKL表达增高,且多数CD68阳性巨噬细胞与p-RIP3及p-MLKL共定位。此外,AIH患者肝组织RIP3和MLKL m RNA表达水平高于对照组。2.多个证据表明Con A诱导的免疫性肝炎小鼠模型建立成功。与对照组相比,Con A造模组小鼠血清ALT和AST水平显著升高,肝脏炎细胞浸润和点状坏死增加,此外肝脏RIP3及MLKL m RNA表达水平显著升高。与Con A组相比,糖皮质激素治疗显著降低Con A诱导的小鼠血清转氨酶水平,减轻肝脏炎细胞浸润,同时显著降低了肝脏RIP3和MLKL m RNA的表达,提示RIP3信号是激素治疗免疫性肝炎的作用靶点之一。值得关注的是,RIP3抑制剂GSK872治疗显著提高Con A受体小鼠存活率,降低血清转氨酶水平和脾重,减少肝脏炎细胞浸润和点状坏死,显示出有效的抗炎保肝作用。3.Raw264.7巨噬细胞系用于探究RIP3活性对巨噬细胞功能的影响。巨噬细胞经LPS刺激后促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3)和趋化因子(CCL2、CCL5)表达增高,同时RIP3和MLKL表达上调。使用RIP3抑制剂GSK872可显著下调促炎因子和趋化因子的表达。使用RIP1抑制剂显著下调IL-6、IL-1β、CCL2和CCL5的表达,而对TNF-α和NLRP3的表达无显著影响。然而,使用凋亡抑制剂Z-VAD不能有效下调LPS诱导的上述促炎因子和趋化因子的表达。表明RIP3信号通路是调控巨噬细胞活化的关键。4.Con A造模小鼠肝脏炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3)和趋化因子(CCL2、CCL5)表达增高,GSK872和激素治疗均显著降低Con A造模小鼠肝脏炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3)和趋化因子(CCL2、CCL5)的表达。Con A造模小鼠肝脏F4/80阳性巨噬细胞比例增加,AIH患者肝脏CD68阳性巨噬细胞和MAC387阳性单核来源巨噬细胞数目均增多,表明巨噬细胞积累参与了免疫性肝损伤。重要的是,GSK872治疗显著降低Con A受体小鼠肝脏巨噬细胞比例。此外,Con A组小鼠肝脏和脾脏CD11b~+Gr-1~+MDSCs数目较对照组小鼠显著上升,而外周血MDSCs比例显著低于对照组。GSK872和激素治疗均显著升高小鼠肝脏、外周血、脾脏MDSCs比例。表明RIP3抑制剂和糖皮质激素可增加具有免疫抑制作用的MDSCs的积累。结论AIH患者肝组织巨噬细胞中RIP3信号激活。阻断RIP3信号可能通过调控肝脏炎性因子的表达和免疫细胞的浸润减轻Con A诱导的小鼠肝脏炎症和损伤。RIP3信号是糖皮质激素的作用靶点之一,其可能成为未来治疗AIH的新靶点。