【摘 要】
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22-羟基-23,24-双降甾-4-烯-3-酮（HBC）是一种有价值的甾体药物中间体,可以通过新金分枝杆菌WⅢ生物转化植物甾醇（PS）产生。本研究针对甾醇转化过程中由于冗余1位脱氢酶的存在导致母核降解和生成副产物的问题开展相关探究。通过在生长培养基MYC/04中添加3 g/L酵母粉（YE）培养获得的菌体建立了具有明显1位脱氢酶活差异的模式反应,1位脱氢产物1,4-HBC的产量从0.21 g/L增加
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22-羟基-23,24-双降甾-4-烯-3-酮（HBC）是一种有价值的甾体药物中间体,可以通过新金分枝杆菌WⅢ生物转化植物甾醇（PS）产生。本研究针对甾醇转化过程中由于冗余1位脱氢酶的存在导致母核降解和生成副产物的问题开展相关探究。通过在生长培养基MYC/04中添加3 g/L酵母粉（YE）培养获得的菌体建立了具有明显1位脱氢酶活差异的模式反应,1位脱氢产物1,4-HBC的产量从0.21 g/L增加到1.14 g/L。对有无添加酵母粉培养的不同菌体进行高通量转录组测序,分析结果显示酵母粉的加入显著影响了脂肪酸代谢和细胞膜合成代谢途径的基因表达,并结合已有相关研究定位到8个可能具有1位脱氢作用的功能基因fadE28/29/30/31/32/33/34和rs0113230。通过在分枝杆菌过表达的方式对这8个功能基因进行体内功能验证,验证了 3个具有1位脱氢作用的候选脱氢酶FadE33,FadE34和RS0113230。再进一步在大肠杆菌中异源表达FadE34和RS0113230,以AD和HBC为底物进行全细胞催化活性验证,结果表明BL21-pET28a-f adE34对HBC和AD的1位脱氢作用最明显,而BL21-pET28a-rs0113230对HBC和A D的1位脱氢活性较弱,尤其是对HBC。最后对FadE34和RS0113230采用镍柱亲和层析的方法进行分离纯化且通过DCPIP法体外验证酶活,结果表明FadE34和RS0113230在体外都偏好以AD作为底物发挥1位脱氢作用,酶的比活分别为38.3mU/mg,15.2m U/mg。针对在环糊精静息细胞高底物浓度（CPS=50 g/L）体系下甾醇转化效率低的问题,通过强化胆固醇氧化酶（ChoM2）克服了限制性步骤和在转化体系中添加5 g/L大孔吸附树脂D101原位吸附抑制性中间体4-烯-3-酮类固醇缓解其抑制作用,从而使甾醇转化时间从3.5 d缩短至2.5 d,时空产率从9.36 g/L/d增加到13.21 g/L/d,提高了 41.13%。
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