恶性肿瘤目前一直是造成人们死亡率的重要因素。化疗成为恶性肿瘤防治的重要手段之一,发挥非常显著的治疗效果。然而,多次给药后,肿瘤对化疗药物的敏感性降低仍然是临床上阻碍癌症治疗最大的挑战。因此,在肿瘤治疗领域中不断探究并发现新型抗肿瘤药物,依然是药物研发至关重要的任务,对于癌症患者的治疗具有极大意义。组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases,HDACs）包括11种家族成员,并根据与各自的酵母同源基因的同源性分为Ⅰ-Ⅳ类。HDACs被认为是一种组蛋白修饰剂,修饰细胞中与遗传过程无关的各种蛋白。HDACs可以去除组蛋白及其它蛋白中的乙酰基,导致基因转录下调和随后信号转导的改变。HDAC抑制剂（Histone deacetylase inhibitor,HDACi）作为一种表观遗传基因调控因子调节剂,由于其对炎症、细胞分化和杀伤肿瘤作用的影响,目前已成为一种具有很好潜在治疗作用的表观遗传药物。许多临床试验已经证明,HDACi对恶性血液疾病、胸腺瘤和黑色素瘤的疗效较好,而且在多项临床前研究中HDACi对晚期肝癌的疗效也表现出显著的优越性。HDACi可以通过多种机制调节基因表达,发挥抗肿瘤作用。但是,其作用机制不尽相同,主要取决于癌症的类型、HDACi的结构、剂量等因素。从目前已有的研究来看,大多数HDACi具有抗肿瘤活性的机理主要包括:调控免疫应答,调节非编码RNA和特定信号途径表达,诱导自噬,抑制血管形成,以及对细胞周期和凋亡产生影响等。此外,不同肿瘤的体内外研究结果也表明,HDACi与多种抗肿瘤药物联合使用,或与放疗联合使用,都能产生协同作用。总之,HDACi在抗肿瘤方面具有极大的潜能,值得深入研究。本论文使用的新型HDACi HXB-9L、HXB-9K是我院药化专业使用Hoechst 33258的苯并咪唑环作为帽基,与SAHA的连接基进行杂交结合而设计的DNA/HDAC的双靶点HDACi。基于此,我们使用SAHA作为阳性药物评估化合物HXB-9L、HXB-9K的体内外抗肿瘤活性。通过对新型HDACi抗肿瘤活性潜在机制的研究,为黑色素瘤和HCC（Hepatocellular carcinoma,HCC）的临床治疗提供新的思路和实验依据。研究目的1.利用不同肿瘤细胞筛选具有较强抗肿瘤活性的新型HDACi;2.探讨新型HDACi的体内外抗肿瘤效应;3.分析新型HDACi对荷瘤小鼠模型中免疫系统的影响;4.为HDACi药物研发提供实验依据。研究方法1.以 SAHA 作为阳性对照,新型 HDACi 处理 B16F10、MC38、Hepa 1-6、Huh-7、Hep 3B 细胞 48 h,采用 MTT（Methyl thiazolyl tetrazolium）法检测其细胞活力。2.以SAHA作为阳性对照,不同浓度的新型HDACi处理B16F10、Hepa 1-6、Huh-7细胞 24 h,采用 Annexin V/7-AAD（7-amino-actinomycin D,7-AAD）试剂盒检测不同细胞凋亡水平。3.以SAHA作为阳性对照,不同浓度的新型HDACi处理B16F10、Hepa 1-6、Huh-7细胞24 h,采用PI流式细胞术检测细胞周期变化。4.使用白枪尖在铺满培养板底部的B16F10细胞上划线,使用不同浓度的新型HDACi处理B16F10细胞24 h,通过显微镜观察并拍摄创面愈合程度,使用Image J软件测量图像中B16F10细胞的迁移情况。5.通过OncoLnc数据库分析新型HDACi靶点HDAC1或HDAC2与HCC患者预后的相关性。6.以SAHA作为阳性对照,新型HDACi处理Hepa 1-6、Huh-7细胞7天,使用多聚甲醛固定,结晶紫染色。然后在显微镜下拍摄Hepa 1-6和Huh-7细胞的集落形成情况。7.以SAHA作为阳性对照,新型HDACi处理Hepa 1-6细胞、Huh-7细胞24 h,qPCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）检测干性相关分子的表达。8.使用超低黏附培养板培养Hepa 1-6细胞和Huh-7细胞,然后以SAHA作为阳性对照,用新型HDACi处理7天,显微镜下拍摄肿瘤球体的形成过程。9.Hepa 1-6细胞和Huh-7细胞在超低黏附培养板中培养7天,形成HCC肿瘤细胞球,然后以SAHA作为阳性对照,新型HDACi处理24 h后,显微镜下拍摄肿瘤球体形态的变化。10.以SAHA作为阳性对照,新型HDACi处理HCC细胞球48 h,MTT法检测肿瘤球的活力。11.以SAHA作为阳性对照,新型HDACi处理HCC细胞球24 h,qPCR检测肿瘤球干性相对分子的表达。12.将不同细胞数的肿瘤细胞皮下注射到6周龄C57BL/6J小鼠腋下,待肿瘤长至一定大小后,给予Vehicle和不同HDACi治疗。绘制治疗期间小鼠体重曲线、小鼠肿瘤生长曲线,并且在各组小鼠安乐死后拍摄皮下肿瘤的代表性图像,称取小鼠的肿瘤重量。13.荷瘤小鼠处死后,分离小鼠不同组织部位、肿瘤组织中淋巴细胞,采用流式细胞术检测各免疫细胞比例及其相关分子表达的变化。14.对荷瘤小鼠的肿瘤组织和肾、心、肝、肺、脾进行固定包埋,切成5 μm的切片,用HE染色,进行组织毒性检测。研究结果1.新型HDACi抑制肿瘤细胞增殖使用MTT法检测新型HDACiHXB-9L、HXB-9K在不同肿瘤细胞中的IC50值。结果显示,相较于对照SAHA,化合物HXB-9L、HXB-9K在B16F10及Hepa 1-6、Huh-7、Hep 3B细胞中的IC50值显著降低,在MC38细胞中三者的IC50没有显著性差异。2.新型HDACi促进肿瘤细胞凋亡使用Annexin V-APC/7-AAD-PerCP双染法检测新型HDACi对不同肿瘤细胞凋亡的影响。可以看出,在较高浓度处理B16F10细胞时,HXB-9L、HXB-9K显示出比对照SAHA更强的促凋亡作用,而处理Hepa 1-6、Huh-7细胞时,促进HCC细胞凋亡的程度与SAHA类似。3.新型HDACi诱导细胞周期阻滞使用PI染色流式细胞术检测新型HDACi HXB-9L、HXB-9K对B16F10、Hepa 1-6、Huh-7细胞周期的影响。化合物HXB-9L、HXB-9K在低浓度、高浓度处理B16F10细胞24h,可诱导细胞周期阻滞,其效果与阳性药物SAHA类似,表现为化合物处理组显著升高G0/G1期Hepa 1-6细胞比例,降低S期比例;明显升高G2期Huh-7细胞比例,降低S期比例。HXB-9L、HXB-9K处理HCC细胞系Hepa 1-6、Huh-7细胞24h,同样可诱导HCC细胞周期阻滞,其效果与阳性药物SAHA类似,表现为Hepa 1-6细胞G0/G1期细胞比例明显上调,S期细胞比例降低;Huh-7细胞G2期细胞比例显著上调,S期细胞比例显著降低。4.新型HDAGi抑制B16F10细胞迁移通过划痕实验检测新型HDACi对B16F10细胞迁移能力的影响。与SAHA相比,化合物HXB-9L、HXB-9K抑制B16F10细胞迁移的作用更强。5.HDAC1、HDAC2较低的HCC患者拥有较好的预后通过OncoLnc数据库（http://www.oncolnc.org/）分析了新型HDACi靶点 HDAC1、HDAC2与肝癌患者预后之间的关系。数据分析显示,相较于HDAC1、HDAC2表达较高的肝癌患者,HDAC1、HDAC2较低者生存期延长。6.新型HDACi抑制HCC细胞集落形成能力通过集落形成实验评价新型HDACi对HCC细胞集落形成能力的影响。结果显示,与阳性药物SAHA相比,化合物HXB-9L、HXB-9K处理组的克隆形成数量显著减少。7.新型HDACi抑制HCC细胞干性相关分子表达通过荧光定量PCR检测新型HDACi对肝癌细胞干性相关分子c-Myc、Nanog、Klf4（Krüppel-like factor 4,Klf4）、Epcam（Epithelial cell adhesion molecule,Epcam）表达的影响。与Ctrl组相比,HXB-9L、HXB-9K明显下调Hepa 1-6细胞中c-Myc、Nanog、Klf4的表达,以及Huh-7细胞中c-Myc、Nanog、Epcam的表达,这一现象与阳性药物SAHA类似。8.新型HDACi抑制HCC细胞成球能力通过观察Hepa 1-6、Huh-7细胞球体的形态和数量,探究新型HDACi对肿瘤细胞干性的影响。结果显示,与阳性药物SAHA相比,化合物HXB-9L、HXB-9K处理组的HCC干性细胞球形成数量明显减少。9.新型HDACi抑制HCC干细胞球的细胞活力通过JuLITM Stage仪器实时监测,化合物HXB-9L、HXB-9K处理可以明显破坏Hepa 1-6细胞和Huh-7细胞诱导形成的肿瘤球体形态,导致球体发生明显的裂解破碎。进一步,对化合物处理的HCC细胞球进行活性检测,发现与对照SAHA相比,化合物HXB-9L、HXB-9K可以显著抑制HCC干细胞球的活力,并存在剂量依赖性。10.新型HDACi抑制HCC干细胞球干性相关分子表达通过荧光定量PCR检测新型HDACi化合物处理HCC干细胞球干性相关分子在mRNA（Messenger ribonucleic acid,mRNA）水平的变化。与对照组相比,化合物HXB-9L、HXB-9K处理,能够明显下调Hepa 1-6细胞以及Huh-7细胞中Epcam、Nanog、c-Myc等干性相关分子的表达,且这一现象在Hepa 1-6细胞中要优于阳性药物SAHA。11.新型HDACi能够抑制小鼠皮下移植瘤模型中肿瘤的生长11.1新型HDACi抑制B16F10皮下移植瘤模型肿瘤生长在B16F10皮下荷瘤模型中,相较于阳性药物SAHA,化合物HXB-9L、HXB-9K治疗后肿瘤体积均明显减小,并且持续给药过程中,化合物HXB-9L和阳性药物SAHA组的小鼠体重波动范围最小,其次是HXB-9K组。在肿瘤组织中,与Vehicle组相比,HXB-9L、HXB-9K治疗组肿瘤的异质性均有所降低,并且这一种现象也存在于阳性药物SAHA治疗组中。11.2新型HDACi抑制Hepa 1-6皮下移植瘤模型肿瘤生长与Vehicle组相比,化合物HXB-9L、HXB-9K及SAHA对小鼠体重均没有明显的影响,且均具有显著的抗肿瘤活性。化合物HXB-9K与SAHA的抑制肿瘤作用相近,肿瘤体积均明显减小,而HXB-9L治疗效果较弱。12.新型HDACi对荷瘤小鼠抗肿瘤免疫的影响12.1新型HDACi对黑色素瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫的影响与Vehicle组相比,HXB-9L、HXB-9K处理组的荷瘤小鼠脾脏中,T细胞、CD8+T和CD4+T细胞比例均增多,同时CD8+T、CD4+T细胞CD107a、ICOS、CD69和IFNγ（Interferon-γ,IFNγ）表达均显著上调,且HXB-9L对T细胞的上述作用更加显著;脾脏中巨噬细胞比例表达上调,且共刺激分子CD86表达也显著上调;DCs（Dendriticcells,DCs）比例无明显变化,但CD86表达显著上调。此外,肿瘤组织中浸润的Treg细胞比例降低;MDSCs（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）的活化指标 CD200R 表达下调,肿瘤浸润的免疫负调细胞的抑制活性受到抑制。并且HXB-9L及HXB-9K能够参与巨噬细胞的表型转化,显著降低肿瘤组织中巨噬细胞比例,特别是M2型巨噬细胞,导致其促肿瘤的功能受到抑制。12.2新型HDACi对HCC荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫的影响与Vehicle组相比,化合物HXB-9K及SAHA治疗组,肿瘤浸润淋巴细胞数量显著增加。其中,化合物HXB-9K、SAHA治疗能够促进DCs和巨噬细胞在肿瘤部位的浸润数量,并且表达MHCII、IL-12、CD86的抗原递呈细胞数目明显增多。同时,在肿瘤微环境中,化合物HXB-9K、SAHA处理组中CD4+T细胞、CD8+T细胞比例上调,并且其功能分子表达也显著升高,包括增殖标志分子Ki67,活化相关分子CD107a、ICOS、CD69以及效应细胞因子TNFα（Tumor necrosis factor-α）。化合物HXB-9K的上述效果强于阳性药物SAHA,而化合物HXB-9L则没有类似的作用。此外,与Vehicle组相比,化合物HXB-9K及SAHA治疗组也可以明显增加NK（Natural killer cells）细胞和NKT（Natural killer T cells）细胞的浸润数量,上调活化相关分子ICOS、TNFα的表达。在淋巴结中,与Vehicle组相比,化合物HXB-9L、HXB-9K治疗组的CD4+T细胞、CD8+T细胞比例发生显著性上调,且T细胞效应因子TNFα的表达上调,并且这种现象与阳性药物SAHA治疗组类似。13.新型HDACi对小鼠主要脏器的影响结果显示,与Vehicle组相比,化合物HXB-9L、HXB-9K以及SAHA治疗后,对小鼠心、肝、脾均没有明显的影响。在肺组织中,小鼠荷瘤后肺部结构表现出明显的损伤,HXB-9L、SAHA治疗后,肺部损伤程度有所缓解,而HXB-9K治疗组这种损伤无明显缓解。在肾组织中,HXB-9L、SAHA治疗后肾小球结构受到明显损伤,而HXB-9K治疗组的损伤程度较轻微。结论及意义1.新型HDACi HXB-9L、HXB-9K能够抑制肿瘤细胞增殖,其作用机制是通过在B16F10、Hepa 1-6、Huh-7细胞中诱导细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞。2.新型HDACi HXB-9L、HXB-9K在Hepa 1-6、Huh-7细胞中能够抑制克隆形成、肿瘤细胞干性、以及抑制其干性相关分子的表达,也能够破坏HCC干性细胞球的形态,抑制干性细胞球活力和干性相关分子的表达。3.通过B16F10皮下荷瘤模型证明了新型HDACi HXB-9L、HXB-9K发挥抗肿瘤作用主要包括两个方面:一是对肿瘤细胞造成直接的杀伤作用;二是参与调节抗肿瘤免疫,包括促进抗原递呈细胞和T细胞的活化,抑制免疫负调细胞浸润,参与巨噬细胞的表型转化。4.通过Hepa 1-6皮下荷瘤模型证明了新型HDACi HXB-9L、HXB-9K发挥抗肿瘤作用主要包括两个方面:一是对于肿瘤细胞的直接杀伤作用;二是能够激活抗肿瘤免疫杀伤肿瘤细胞,包括抗原递呈细胞、NK细胞、T细胞以及NKT细胞的浸润增多和活化激活。5.通过对荷瘤小鼠的脏器进行毒性检测,发现HXB-9L存在一定的肾毒性,HXB-9K存在一定的肺毒性,这为药化专业后续对新型HDACi结构进一步优化提供了实验基础。6.该研究初步探索了新型HDACi抗肿瘤活性的潜在机制,为黑色素瘤和HCC的临床用药治疗提供了实验依据。