【摘 要】
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目的:通过建立ACAID体外模型,选取调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）为研究对象,以抗Tim-1抗体RMT1-10作为干预药物,明确角膜移植免疫排斥反应中调节性B细胞对ACAID的作用及机制。方法:F4/80+APC细胞和B细胞的磁珠分选纯化后共培养,分别采用Western-blot技术、PCR技术以及FACS技术检测该共培养体系中Tim-1蛋白表达、Tim-1m
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目的:通过建立ACAID体外模型,选取调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）为研究对象,以抗Tim-1抗体RMT1-10作为干预药物,明确角膜移植免疫排斥反应中调节性B细胞对ACAID的作用及机制。方法:F4/80+APC细胞和B细胞的磁珠分选纯化后共培养,分别采用Western-blot技术、PCR技术以及FACS技术检测该共培养体系中Tim-1蛋白表达、Tim-1m RNA表达和Tim-1+IL-10+细胞比例;观察RMT1-10对该共培养体系的干预作用。将上述培养体系中ACAID B细胞和天然CD4+T细胞分选纯化后共培养,采用FACS技术观察ACAID B细胞对CD4+T细胞分化及其细胞因子分泌的影响;观察IL-10阻断对该共培养体系的干预作用;采用Luminex技术检测该共培养系统上清液中细胞因子含量。采用FACS技术观察ACAID B细胞对CD4+T细胞增殖和凋亡的影响;观察IL-10阻断的干预作用。采用局部过继转移（LAT）实验检测获取自上述共培养体系的T细胞对DTH实验的影响。结果:F4/80+细胞与B细胞共培养体系中:Tim-1蛋白表达发生了明显改变,其中F4/80+细胞+B细胞组Tim-1蛋白相对表达量较单独B细胞培养组明显增多且对RMT1-10具有明显的剂量依赖性。F4/80+细胞+B细胞组Tim-1m RNA表达量较单独B细胞培养组明显增多也对RMT1-10具有明显的剂量依赖性。F4/80+细胞+B细胞组Tim-1+IL-10+细胞百分比与单独B细胞培养组没有明显差异,与添加RMT1-10同型对照组相比也没有明显差别,但对添加的RMT1-10同样具有明显的剂量依赖性。ACAID B细胞与CD4+T细胞共培养体系中:FACS检测结果显示:CD4+IFN-γ细胞比例随ACAID B细胞增加而减少。IL-10阻断后,CD4+IFN-γ+细胞比例较IL-10未阻断对照组明显增多。CD4+IL-17细胞比例随ACAID B细胞增加而减少,但在IL-10阻断后,CD4+IL-17+细胞比例仅在T:B为2:1和1:1时较IL-10未阻断对照组略微增多,其他比例下没有明显差异。CD4+Foxp3+细胞比例随着ACAID B细胞增加而增多。IL-10阻断后,CD4+Foxp3+细胞比例较未阻断对照组明显减少且随ACAID B细胞增多而减少。Luminex检测结果显示:共培养体系上清液中IL-10含量随ACAID B细胞增加而增加,相反,IFN-γ和IL-17含量随着ACAID B细胞增加而减少。增殖抑制试验结果显示:CD4+T细胞凋亡率随ACAID B细胞增加而减少,IL-10阻断可以升高CD4+T细胞的凋亡率。CD4+T细胞的增殖率随ACAID B细胞增多而上升,而阻断IL-10使CD4+T细胞的增殖率明显上升。LAT检测结果显示:ACAID体外模型中的T细胞能明显抑制DTH反应,经过RMT1-10干预的ACAID模型脾细胞抑制能力较未干预组更强。结论:Tim-1+Bregs参与ACAID形成,其作用为促进CD4+T细胞增殖抑制其凋亡,使其分化发生由Th1和Th17偏向Tregs方向,诱导生成抑制性Tregs细胞,最终抑制DTH反应。由于这一过程可以被RMT1-10所增强,因此也为阐明RMT1-10的作用机制和优化角膜移植排斥反应防治方案制定提供了理论依据。
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