【摘 要】
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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一类家畜和野猪的高传染性病毒性疾病,主要临床表现有高烧、出血和皮肤发绀等,急性型感染猪的死亡率高达100%。20世纪20年代,ASF疫情首次在肯尼亚爆发,此后在世界各地不断流行,给我国养殖业发展造成了巨大的威胁。由于目前还没有有效的商业化疫苗或治疗药物,因此在现场快速、高度敏感和高度特异的ASFV检测方法对于早期管理至关重要。近几年来,一
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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一类家畜和野猪的高传染性病毒性疾病,主要临床表现有高烧、出血和皮肤发绀等,急性型感染猪的死亡率高达100%。20世纪20年代,ASF疫情首次在肯尼亚爆发,此后在世界各地不断流行,给我国养殖业发展造成了巨大的威胁。由于目前还没有有效的商业化疫苗或治疗药物,因此在现场快速、高度敏感和高度特异的ASFV检测方法对于早期管理至关重要。近几年来,一种新的基因编辑工具-基于pfAgo蛋白的限制性内切酶被报道出来用于核酸检测。研究表明,该方法最低可检测到单拷贝,比传统方法易操作、更经济,并且pfAgo蛋白可以识别靶标DNA的任意区域,在体外诊断具有极大的优势。本研究首先将合成的pET28a-pfAgo的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)/p Lys S感受态细胞,然后进行pfAgo蛋白的诱导表达和纯化,并使用Western Blot对pfAgo蛋白进行验证。用20%TBE-PAGE试验检测pfAgo蛋白是否具有预期活性。在NCBI上下载多株ASFV-p72基因组全序列,使用Meglign软件进行序列比对,获得保守序列。针对保守序列设计g DNA引物和ERA引物进行筛选,初步建立基于pfAgo蛋白的荧光法和试纸条法反应体系后,在多方面进行优化,使用优化后的条件探究最低检测下限和特异性。最后,对猪常见病毒猪临床样本进行检测,将建立的基于pfAgo蛋白检测方法与标准化非洲猪瘟试剂盒检测结果进行对比。结果显示:本研究成功制备出了高纯度的pfAgo蛋白并具有切割活性。引物筛选得到g72-6-1为合适的g DNA引物,F1和R2为最佳的ERA引物对;模板经过等温扩增后效果更佳,灵敏度试验表明荧光法最低可检测到4 copies/μL,试纸条法最低可检测到80copies/μL。特异性试验证明基于pfAgo蛋白的两种方法都具有高度专一性,不与其他重要的猪病毒产生交叉反应,并且两种方法与青岛立见非洲猪瘟标准化试剂盒相比,具有应用于对临床样本检测的潜力。综上所述,本研究成功建立了两种基于pfAgo蛋白快速检测ASFV-p72基因的检测方法,具有高灵敏度和高特异性。该方法为ASFV的检测提供了新的技术支持,将pfAgo蛋白推广至快速检测动物病原微生物领域。
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