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研究目的：
胰腺癌是一种常见的癌症类型，被称为“癌中之王”，其起病隐匿，恶性度高，早期易转移，对传统放化疗不敏感，手术切除率低。由于胰腺癌的发生发展机制复杂，缺乏有效的早期诊断及治疗，致使胰腺癌患者死亡率较高。因此，研究胰腺癌的发生发展的内在机制并寻找胰腺癌有效的治疗靶点尤为重要。研究表明，一种三萜类化合物CDDO的衍生物CDDO-Me在多种肿瘤中表现出较好的抗肿瘤活性，尤其是白血病。最近有研究报道了CDDO-Me可以通过靶向hTERT和ROS生成抑制胰腺癌生长，防止胰腺癌复发。然而，关于CDDO-Me抑制胰腺癌的机制尚不充分，因而探究其对胰腺癌具体作用机制仍是亟待解决的重要科学问题。因此，本文将深入探究CDDO-Me抑制胰腺癌的具体作用机制，期望为胰腺癌的有效治疗提供实验基础及新的实验依据。
研究方法：
1、应用细胞增殖实验、克隆形成实验、裸鼠荷瘤实验评价CDDO-Me对胰腺癌细胞（体外&体内）生长的影响。
2、应用Western Blot蛋白质免疫印迹技术分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞mTOR信号通路相关分子的表达水平。
3、应用Seahorse XFe96细胞生物能量分析仪分析CDDO-Me对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
4、应用Western Blot技术分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞糖酵解相关催化酶的表达水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
5、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞的氧耗率及相关指标的变化水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞氧化磷酸化的影响。
6、应用Mito-Tracker对对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体特异性荧光染色，使用共聚焦显微镜观察CDDO-Me处理对胰腺癌细胞线粒体大小及数量的影响。
7、应用膜电位检测试剂盒结合流式细胞术分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体的膜电位，评价CDDO-Me处理对胰腺癌细胞线粒体稳态的影响。
8、应用Western Blot蛋白质免疫印迹技术分析照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体动力学蛋白的表达，评估CDDO-Me影响线粒体氧化磷酸化的相关因素。
9、应用流式细胞仪分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC处理组胰腺癌细胞活性氧水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞ROS产生的影响。
10、应用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC处理组胰腺癌细胞的生长情况，评价CDDO-Me诱导的ROS对胰腺癌细胞生长的影响。
11、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC处理组胰腺癌细胞氧耗率，评价CDDO-Me诱导的ROS对胰腺癌细胞线粒体氧化磷酸化的影响。
12、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC组胰腺癌细胞有氧糖酵解相关指标，评价CDDO-Me诱导的ROS对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
13、应用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、裸鼠荷瘤实验评价SLC1A5敲低对胰腺癌细胞（体外&体内）生长的影响。
14、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组及SLC1A5敲除组胰腺癌细胞的氧耗率及相关指标，评价SLC1A5敲低对胰腺癌细胞氧化磷酸化的影响。
15、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组和SLC1A5敲低组胰腺癌细胞有氧糖酵解相关指标，评价SLC1A5敲低对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
16、通过实时荧光定量PCR测定对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞SLC1A5的mRNA转录本水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞SLC1A5的mRNA转录本的影响。
17、应用Western blot技术测定胰腺癌细胞对照组、TM处理组、TM+MG132处理组CDDO-Me处理组及CDDO-Me+MG132处理组胰腺癌细胞SLC1A5蛋白水平，分析CDDO-Me是否通过SLC1A5糖基化修饰影响SLC1A5的蛋白稳定性。
18、应用生物信息学方法分析SLC1A5在不同肿瘤中的表达情况，以及SLC1A5在不同临床分期胰腺癌患者肿瘤组织中的表达水平及与患者生存之间的相关性。
研究结果：
1、CDDO-Me显著抑制胰腺癌细胞的生长（体外&体内），体外实验显示随CDDO-Me浓度升高，抑制作用增强。
2、CDDO-Me显著抑制胰腺癌细胞mTOR信号通路转导（显著降低p-mTOR、p-S6R、p-4EBP1和p-ERK1/2的蛋白水平）。
3、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞总体ECAR显著降低（随CDDO-Me浓度升高，ECAR降低程度增大），细胞乳酸产量显著降低；高浓度条件下CDDO-Me显著降低胰腺癌细胞的最大糖酵解速率及储备糖酵解速率。
4、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞糖酵解相关催化酶PFKM、PKM2及HKII均不同程度降低，随CDDO-Me浓度升高，催化酶降低程度增大。
5、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞总体氧耗率显著降低，随CDDO-Me浓度升高，总体氧耗率降低程度增大；CDDO-Me处理组胰腺癌细胞最大呼吸、ATP产量、细胞的氧化磷酸化偶联效率、细胞储备呼吸及储备呼吸百分比显著降低。
6、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞器线粒体变小，数量降低。
7、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体膜电位显著降低（随CDDO-Me浓度升高，膜电位下降程度增大）。
8、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体动力学蛋白OPA1发生明显切割，线粒体分裂关键分子DRP1及融合相关键分子MFN1与MFN2均不同程度降低。
9、CDDO-Me显著增加胰腺癌细胞ROS水平（随CDDO-Me浓度升高，ROS增加更明显），并可被NAC有效清除。
10、应用NAC清除CDDO-Me导致的胰腺癌细胞ROS增加，可显著缓解由CDDO-Me导致的细胞生长抑制。
11、应用NAC清除CDDO-Me诱导的胰腺癌细胞ROS增加，可有效缓解由CDDO-Me导致的线粒体总体氧耗率、线粒体最大呼吸、ATP产量及线粒体储备呼吸的降低。
12、应用NAC可显著缓解由CDDO-Me所诱导的有氧糖酵解抑制，较好的缓解由CDDO-Me导致的最大糖酵解速率、储备糖酵解速率及乳酸产量的降低。
13、敲低SLC1A5显著抑制胰腺癌细胞的生长（体外&体内）。
14、敲低SLC1A5显著降低胰腺癌细胞的总体氧耗率，显著抑制细胞基础呼吸、最大呼吸、ATP产生及细胞储备呼吸。
15、敲低SLC1A5显著抑制胰腺癌细胞总体有氧糖酵解过程及非糖酵解的产酸过程。16、对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞SLC1A5的mRNA转录本无显著差异。
17、应用TM处理后SLC1A5发生去糖基化，非糖基化修饰的SLC1A5的蛋白条带位置显著降低，再联合MG132处理后，非糖基化的SLC1A5较TM处理组有不同程度的上升；CDDO-Me处理组SLC1A5水平显著降低，CDDO-Me再加MG132处理可显著增加SLC1A5的蛋白质水平。
18、SLC1A5在多种肿瘤中表现为不同程度的高表达，在胰腺癌中SLC1A5的mRNA转录本以扩增为主；随着胰腺癌临床分期的进展，SLC1A5的转录本显著升高；高表达SLC1A5的胰腺癌患者预后更差。
研究结论：
本课题首先通过细胞及动物实验验证了CDDO-Me抑制胰腺癌细胞生长的关键作用，并以细胞生物能量代谢为切入点，初步揭示了CDDO-Me通过显著抑制胰腺癌细胞有氧糖酵解及氧化磷酸化过程发挥其抗肿瘤活性。通过对糖酵解相关催化酶表达水平的分析发现，CDDO-Me通过抑制糖酵解相关催化酶的表达进而抑制细胞有氧糖酵解过程。CDDO-Me处理后细胞线粒体变小，数量降低，线粒体融合及分裂减少，并且线粒体发生去极化。这些作用可能是其抑制线粒体氧化磷酸化的重要因素。进一步发现CDDO-Me抑制胰腺癌细胞生长、细胞线粒体氧化磷酸化及有氧糖酵解过程依赖于其诱导的ROS增加。更重要的是，本研究发现CDDO-Me通过调控谷氨酰胺转运体SLC1A5的表达来诱导ROS产生，抑制胰腺癌细胞生长及能量代谢。SLC1A5为CDDO-Me的潜在作用靶点，CDDO-Me可显著降低SLC1A5的蛋白质表达。体外体内实验验证了敲低SLC1A5显著抑制胰腺癌细胞在体内体外的生长、细胞线粒体氧化磷酸化及有氧糖酵解过程。同时，研究揭示了CDDO-Me可能通过抑制SLC1A5蛋白N-糖基化修饰促进其降解。最后，应用生物信息学方法分析了SLC1A5表达与胰腺癌患者预后的相关性，结果显示SLC1A5在多种肿瘤中表现为不同程度的高表达，与高表达SLC1A5的胰腺癌患者预后更差，提示SLC1A5为胰腺癌患者重要的预后指标，在胰腺癌发生发展过程中发挥着一定的促癌作用。本研究揭示了CDDO-Me抑制胰腺癌的分子机制，并为胰腺癌的靶向治疗提供了新的靶点和实验依据。
胰腺癌是一种常见的癌症类型，被称为“癌中之王”，其起病隐匿，恶性度高，早期易转移，对传统放化疗不敏感，手术切除率低。由于胰腺癌的发生发展机制复杂，缺乏有效的早期诊断及治疗，致使胰腺癌患者死亡率较高。因此，研究胰腺癌的发生发展的内在机制并寻找胰腺癌有效的治疗靶点尤为重要。研究表明，一种三萜类化合物CDDO的衍生物CDDO-Me在多种肿瘤中表现出较好的抗肿瘤活性，尤其是白血病。最近有研究报道了CDDO-Me可以通过靶向hTERT和ROS生成抑制胰腺癌生长，防止胰腺癌复发。然而，关于CDDO-Me抑制胰腺癌的机制尚不充分，因而探究其对胰腺癌具体作用机制仍是亟待解决的重要科学问题。因此，本文将深入探究CDDO-Me抑制胰腺癌的具体作用机制，期望为胰腺癌的有效治疗提供实验基础及新的实验依据。
研究方法：
1、应用细胞增殖实验、克隆形成实验、裸鼠荷瘤实验评价CDDO-Me对胰腺癌细胞（体外&体内）生长的影响。
2、应用Western Blot蛋白质免疫印迹技术分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞mTOR信号通路相关分子的表达水平。
3、应用Seahorse XFe96细胞生物能量分析仪分析CDDO-Me对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
4、应用Western Blot技术分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞糖酵解相关催化酶的表达水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
5、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞的氧耗率及相关指标的变化水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞氧化磷酸化的影响。
6、应用Mito-Tracker对对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体特异性荧光染色，使用共聚焦显微镜观察CDDO-Me处理对胰腺癌细胞线粒体大小及数量的影响。
7、应用膜电位检测试剂盒结合流式细胞术分析对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体的膜电位，评价CDDO-Me处理对胰腺癌细胞线粒体稳态的影响。
8、应用Western Blot蛋白质免疫印迹技术分析照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体动力学蛋白的表达，评估CDDO-Me影响线粒体氧化磷酸化的相关因素。
9、应用流式细胞仪分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC处理组胰腺癌细胞活性氧水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞ROS产生的影响。
10、应用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC处理组胰腺癌细胞的生长情况，评价CDDO-Me诱导的ROS对胰腺癌细胞生长的影响。
11、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC处理组胰腺癌细胞氧耗率，评价CDDO-Me诱导的ROS对胰腺癌细胞线粒体氧化磷酸化的影响。
12、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组、CDDO-Me处理组及CDDO-Me+NAC组胰腺癌细胞有氧糖酵解相关指标，评价CDDO-Me诱导的ROS对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
13、应用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、裸鼠荷瘤实验评价SLC1A5敲低对胰腺癌细胞（体外&体内）生长的影响。
14、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组及SLC1A5敲除组胰腺癌细胞的氧耗率及相关指标，评价SLC1A5敲低对胰腺癌细胞氧化磷酸化的影响。
15、应用Seahorse XFe96生物能量分析仪分析对照组和SLC1A5敲低组胰腺癌细胞有氧糖酵解相关指标，评价SLC1A5敲低对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。
16、通过实时荧光定量PCR测定对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞SLC1A5的mRNA转录本水平，评价CDDO-Me对胰腺癌细胞SLC1A5的mRNA转录本的影响。
17、应用Western blot技术测定胰腺癌细胞对照组、TM处理组、TM+MG132处理组CDDO-Me处理组及CDDO-Me+MG132处理组胰腺癌细胞SLC1A5蛋白水平，分析CDDO-Me是否通过SLC1A5糖基化修饰影响SLC1A5的蛋白稳定性。
18、应用生物信息学方法分析SLC1A5在不同肿瘤中的表达情况，以及SLC1A5在不同临床分期胰腺癌患者肿瘤组织中的表达水平及与患者生存之间的相关性。
研究结果：
1、CDDO-Me显著抑制胰腺癌细胞的生长（体外&体内），体外实验显示随CDDO-Me浓度升高，抑制作用增强。
2、CDDO-Me显著抑制胰腺癌细胞mTOR信号通路转导（显著降低p-mTOR、p-S6R、p-4EBP1和p-ERK1/2的蛋白水平）。
3、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞总体ECAR显著降低（随CDDO-Me浓度升高，ECAR降低程度增大），细胞乳酸产量显著降低；高浓度条件下CDDO-Me显著降低胰腺癌细胞的最大糖酵解速率及储备糖酵解速率。
4、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞糖酵解相关催化酶PFKM、PKM2及HKII均不同程度降低，随CDDO-Me浓度升高，催化酶降低程度增大。
5、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞总体氧耗率显著降低，随CDDO-Me浓度升高，总体氧耗率降低程度增大；CDDO-Me处理组胰腺癌细胞最大呼吸、ATP产量、细胞的氧化磷酸化偶联效率、细胞储备呼吸及储备呼吸百分比显著降低。
6、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞器线粒体变小，数量降低。
7、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体膜电位显著降低（随CDDO-Me浓度升高，膜电位下降程度增大）。
8、CDDO-Me处理组胰腺癌细胞线粒体动力学蛋白OPA1发生明显切割，线粒体分裂关键分子DRP1及融合相关键分子MFN1与MFN2均不同程度降低。
9、CDDO-Me显著增加胰腺癌细胞ROS水平（随CDDO-Me浓度升高，ROS增加更明显），并可被NAC有效清除。
10、应用NAC清除CDDO-Me导致的胰腺癌细胞ROS增加，可显著缓解由CDDO-Me导致的细胞生长抑制。
11、应用NAC清除CDDO-Me诱导的胰腺癌细胞ROS增加，可有效缓解由CDDO-Me导致的线粒体总体氧耗率、线粒体最大呼吸、ATP产量及线粒体储备呼吸的降低。
12、应用NAC可显著缓解由CDDO-Me所诱导的有氧糖酵解抑制，较好的缓解由CDDO-Me导致的最大糖酵解速率、储备糖酵解速率及乳酸产量的降低。
13、敲低SLC1A5显著抑制胰腺癌细胞的生长（体外&体内）。
14、敲低SLC1A5显著降低胰腺癌细胞的总体氧耗率，显著抑制细胞基础呼吸、最大呼吸、ATP产生及细胞储备呼吸。
15、敲低SLC1A5显著抑制胰腺癌细胞总体有氧糖酵解过程及非糖酵解的产酸过程。16、对照组及CDDO-Me处理组胰腺癌细胞SLC1A5的mRNA转录本无显著差异。
17、应用TM处理后SLC1A5发生去糖基化，非糖基化修饰的SLC1A5的蛋白条带位置显著降低，再联合MG132处理后，非糖基化的SLC1A5较TM处理组有不同程度的上升；CDDO-Me处理组SLC1A5水平显著降低，CDDO-Me再加MG132处理可显著增加SLC1A5的蛋白质水平。
18、SLC1A5在多种肿瘤中表现为不同程度的高表达，在胰腺癌中SLC1A5的mRNA转录本以扩增为主；随着胰腺癌临床分期的进展，SLC1A5的转录本显著升高；高表达SLC1A5的胰腺癌患者预后更差。
研究结论：
本课题首先通过细胞及动物实验验证了CDDO-Me抑制胰腺癌细胞生长的关键作用，并以细胞生物能量代谢为切入点，初步揭示了CDDO-Me通过显著抑制胰腺癌细胞有氧糖酵解及氧化磷酸化过程发挥其抗肿瘤活性。通过对糖酵解相关催化酶表达水平的分析发现，CDDO-Me通过抑制糖酵解相关催化酶的表达进而抑制细胞有氧糖酵解过程。CDDO-Me处理后细胞线粒体变小，数量降低，线粒体融合及分裂减少，并且线粒体发生去极化。这些作用可能是其抑制线粒体氧化磷酸化的重要因素。进一步发现CDDO-Me抑制胰腺癌细胞生长、细胞线粒体氧化磷酸化及有氧糖酵解过程依赖于其诱导的ROS增加。更重要的是，本研究发现CDDO-Me通过调控谷氨酰胺转运体SLC1A5的表达来诱导ROS产生，抑制胰腺癌细胞生长及能量代谢。SLC1A5为CDDO-Me的潜在作用靶点，CDDO-Me可显著降低SLC1A5的蛋白质表达。体外体内实验验证了敲低SLC1A5显著抑制胰腺癌细胞在体内体外的生长、细胞线粒体氧化磷酸化及有氧糖酵解过程。同时，研究揭示了CDDO-Me可能通过抑制SLC1A5蛋白N-糖基化修饰促进其降解。最后，应用生物信息学方法分析了SLC1A5表达与胰腺癌患者预后的相关性，结果显示SLC1A5在多种肿瘤中表现为不同程度的高表达，与高表达SLC1A5的胰腺癌患者预后更差，提示SLC1A5为胰腺癌患者重要的预后指标，在胰腺癌发生发展过程中发挥着一定的促癌作用。本研究揭示了CDDO-Me抑制胰腺癌的分子机制，并为胰腺癌的靶向治疗提供了新的靶点和实验依据。