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目的:心血管病时血流动力学改变伴随着神经内分泌异常,参与心肌细胞(CMs)肥大、间质增生,导致心室肥大和心室腔扩大,即心室重构的过程。心室重构是心血管病重要的病理生理过程。了解心室重构的发病机理和防治心室重构已成为国内外学者研究的热点课题。心肌成纤维细胞(MFs)是心脏中数量最多且主要合成、分泌心脏细胞外基质(ECM)的细胞类型。胶原过度增生、沉积导致心肌纤维化可能是心室重构的主要病理基础。在心室重构过程中,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)在其中起着极为重要的作用,血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)作为RAS最为重要的效应分子,具有众多的生物学活性,与心室重构密切相关,可引起MFs的增生和心脏间质纤维化,心肌肥厚中进行性加重的间质改建是造成肥厚心肌舒缩功能障碍的重要因素。但AngⅡ对MFs增殖及胶原合成的影响及其机制尚不清楚。
本实验通过体外原代提纯培养乳大鼠(1-3d)MFs,研究AngⅡ对MFs增殖、胶原分泌量及蛋白激酶C(PKC)亚型ε和α表达及转位的影响,了解Ang Ⅱ的促增殖和胶原合成作用及信号转导机制,从而在细胞和分子水平上为心肌纤维化发生机制提供新的理论依据,也为防治心室重构开辟新的途径。
方法:本研究以差速贴壁法原代分离提纯培养的SD乳鼠MFs为实验模型,DAB免疫组化法鉴定后传代培养,取第2-4代MFs分实验组(加AngⅡ 10-6mol/L)和对照组(不加Ang Ⅱ)培养;四氮唑盐(MTT)比色法检测MFs的增殖;羟脯氨酸测试盒检测MFs胶原合成量;间接免疫荧光法观察PKC亚型ε和α在细胞内的分布和定位,Image-pro-plus4.0版专业图像处理软件对荧光强度进行半定量统计。
结果:
1.差速贴壁90分钟后分离提纯的MFs传代培养2-4代后,倒置相差显微镜下观察:细胞呈梭形,多角形,漩涡放射状生长。经波形蛋白单克隆抗体DAB免疫组化染色后见到细胞中有棕褐色的,与细胞长轴平行的丝状物,证实为MFs;
2.在106mol/L Ang Ⅱ作用下,MFs的A值较对照组的值明显增加,并且有显著统计学意义(P<0.001);
3.在106mol/L Ang Ⅱ作用下,MFs培养上清羟脯氨酸含量较对照组的值明显增加,并且有显著统计学意义(P<0.001);
4.实验组和对照组荧光显微镜下初步观察PKC亚型ε和α的表达和转位比较:对照组PKC亚型ε存在于膜、胞浆和核-细胞骨架所有三个部分,但都比较弱,而实验组PKC亚型ε在膜、胞浆和核-细胞骨架三个部分强度明显增强,尤以核-细胞骨架为甚;对照组PKC亚型α主要存在于核-细胞骨架,而实验组PKC亚型α在膜、胞浆和核-细胞骨架三个部分强度都明显增加,尤以核-细胞骨架为甚;且PKC亚型ε和α荧光强度半定量比较实验组均显著高于对照组(P<0.001)。
结论:
1.在10-6mol/L Ang Ⅱ作用下,MFs数目增多,提示Ang Ⅱ具有促进MFs细胞增殖的作用;
2.在10-6mol/L Ang Ⅱ作用下,MFs培养上清羟脯氨酸含量明显增加,这提示Ang Ⅱ具有促进MFs合成分泌胶原蛋白的作用;
3.Ang Ⅱ对PKC亚型ε和α在MFs的表达和转位有显著影响,提示PKC亚型ε、α可能在MFs增殖和胶原合成信号转导过程中起重要作用;
4.差速贴壁法(90分钟)原代培养MFs纯度高。