【摘 要】
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研究背景:化疗是肺癌的主要治疗手段之一,临床常用的肺癌化疗药物包括吉西他滨（Gemcitabine,GEM）、铂类、依托泊苷、紫杉醇等。GEM通过其三磷酸代谢物阻止DNA复制/合成,最终导致细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。GEM是目前针对非小细胞肺癌的一线化疗药,但患者产生耐药性后严重影响GEM化疗效果。明确肺癌GEM耐药机制对提高肺癌患者生存率具有重要意义。Cullin4B（CUL4B）是Cullin
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研究背景:化疗是肺癌的主要治疗手段之一,临床常用的肺癌化疗药物包括吉西他滨（Gemcitabine,GEM）、铂类、依托泊苷、紫杉醇等。GEM通过其三磷酸代谢物阻止DNA复制/合成,最终导致细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。GEM是目前针对非小细胞肺癌的一线化疗药,但患者产生耐药性后严重影响GEM化疗效果。明确肺癌GEM耐药机制对提高肺癌患者生存率具有重要意义。Cullin4B（CUL4B）是Cullin-Ring泛素E3连接酶复合物的支架蛋白参与调控多种生长发育过程。已证明,CUL4B参与调控多种肿瘤细胞增殖和迁移。本实验室前期结果显示:在胃癌、膀胱癌等细胞中,敲低CUL4B会增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,提示CUL4B可能参与调控肿瘤化疗耐药。但CUL4B是否调控肺癌GEM耐药目前尚不清楚。研究目的:明确CUL4B在调控肺癌细胞GEM耐药中的作用并探究其相关机制。研究方法:分别构建敲低和过表达CUL4B的肺癌细胞株;通过MTT、EdU掺入实验、克隆形成实验、划痕实验等检测改变CUL4B表达对GEM处理后肿瘤细胞生长、增殖和迁移等影响;Western blot检测改变CUL4B表达对多种耐药相关蛋白表达的影响;芯片检测结合软件分析发现受CUL4B调控并参与耐药蛋白表达调控的候选miRNA;实时荧光定量PCR及ChIP等实验验证miRNA表达及分析调控机制。研究结果:（1）CUL4B表达水平与肺癌细胞对GEM的敏感性相关。对肺癌细胞株H1299和A549中CUL4B表达情况检测发现CUL4B在H1299中的表达水平显著高于A549,而H1299细胞的GEM半抑制浓度显著高于A549细胞的GEM半抑制浓度;改变A549细胞和H1299细胞中CUL4B表达水平,发现敲低CUL4B则提高细胞对GEM的敏感性,而过表达CUL4B显著降低A549细胞和H1299细胞对GEM敏感性。（2）CUL4B正调控耐药相关蛋白ABCB1表达。检测耐药相关蛋白在CUL4B不同表达水平肺癌细胞中的表达情况,发现CUL4B正调控ABCB1蛋白表达,而且是发生在转录后水平。（3）CUL4B通过miR-7-1-3p调控ABCB1表达。利用实验室前期获得的CUL4B敲低A549及对照细胞中miRNA检测结果,结合软件预测,筛选出了 6个可能参与CUL4B调控ABCB1的候选miRNA,实时荧光定量PCR分析证实CUL4B负调控这些候选miRNA转录;利用miRNA mimics/inhibitor处理细胞,发现只有miR-7-1-3p的mimics和inhibitor可以影响ABCB1表达。转染miR-7-1-3p inhibitor可显著减弱由CUL4B敲低引起的GEM敏感性增加,转染miR-7-1-3p mimics则基本恢复了 CUL4B高表达导致的GEM敏感性降低。双荧光素酶报告基因实验提示miR-7-1-3p与ABCB13’-UTR区域结合并调控ABCB1表达。（4）CUL4B复合物协同PRC2、HDAC复合物抑制miR-7-1-3p转录。qChIP实验发现CUL4B可以结合在miR-7-1-3p转录起始点上游-3.0 kb～-2.0 kb区域;进一步分析显示敲低 CUL4B 显著减少 H2AK119ub1、EZH2、H3K27me3、HDAC1 和 HDAC3 在miR-7-1-3p启动子的结合。结论:CUL4B参与调控肺癌细胞GEM耐药;CUL4B协同PRC2复合物及HDAC复合物通过影响组蛋白修饰抑制miR-7-1-3p转录进而促进ABCB1表达。
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