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第一部分BMP4基因在MRKH综合征中的致病机制研究研究背景:MRKH（Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser）综合征是由于苗勒管发育异常所致。尽管该疾病早在19世纪初就已被报道,但目前该疾病的病因仍不明确。由于基因测序技术的飞速进步和使用,多个MRKH综合征候选致病基因被发现。基因BMP4（Bone morphogenetic protein 4）在胚胎分化发育过程中扮演重要的调控作用。目前研究已证实基因BMP4突变可导致骨骼,牙齿、肾脏等多个器官的发育畸形。但是目前尚无BMP4基因突变在MRKH综合征中的致病性研究。研究目的:基于中国大样本MRKH综合征患者队列的测序数据,从细胞及动物模型水平研究BMP4基因突变在MRKH综合征中的致病机制。研究方法:对442例MRKH综合征患者行全外显子测序,筛选出可能致病的BMP4基因突变位点。采用Sanger测序验证突变位点的真实性,然后通过细胞功能试验评估突变位点对BMP4基因在转录、翻译及功能水平的影响。再构建Bmp4flox/flox小鼠与在苗勒管不同部位表达的Cre（Cyclization recombination enzyme）工具小鼠繁育实现特异性敲除苗勒管不同部位组织的Bmp4基因观察其对小鼠苗勒管发育的影响。研究结果:1.在442例MRKH综合征患者的全外显子测序数据中一共筛选出12个BMP4基因可能致病的错义突变位点,分别是:c.305C＞T、c.326G＞T、c.338G＞A、c.450C＞G、c.619C＞G、c.712G＞A、c.751C＞T、c.874C＞T、c.918G＞T、c.925C＞T、c.979G＞A、c.1216G＞A。2.细胞实验发现突变位点c.305C＞T导致BMP4总蛋白表达量降低。位点c.338G＞A、c.450C＞G、c.712G＞A、c.751C＞T、c.925C＞T、c.979G＞A、c.1216G＞A导致BMP4蛋白分泌到细胞外的蛋白量降低或基本不能分泌到细胞外,而位点c.326G＞T、c.918G＞T导致BMP4蛋白分泌到细胞外的量明显增多。蛋白定位实验发现变位点c.326G＞T、c.918G＞T导致BMP4蛋白在胞内定位异常,蛋白成颗粒状,无法进入内质网。3.动物模型实验中 Bmp4flox/flox:Amhr2-Cre 雌性小鼠和 Bmp4flox/flox:Wnt7a-Cre雌性小鼠均出现类似于MRKH综合征患者的生殖道表型,即子宫、阴道发育异常。研究结论:本研究首次发现并证实了BMP4基因突变是导致MRKH综合征的致病原因,扩大了 MRKH综合征的致病基因谱。第二部分BMP7基因在MRKH综合征中的致病机制研究研究背景:女性先天性生殖道畸形是一种因为苗勒管（中肾旁管）在分化发育过程中出现异常导致的先天性疾病,包括MRKH（Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser）综合征、阴道斜隔综合征、阴道闭锁和子宫纵隔等。目前女性先天性生殖道畸形的具体致病机制并不明确。仍需要更多的研究来探寻生殖道畸形的病因。研究已证实基因BMP7（Bone morphogenetic protein 7）在多种组织器官的生长、分化和形成过程中发挥不可或缺的作用。基因BMP7突变可导致骨骼、肾脏、眼睛等多个器官的畸形,但是目前尚无BMP7基因突变在MRKH综合征中致病性的研究。研究目的:基于大样本的生殖道畸形患者队列的全外显子测序数据,从细胞及动物模型水平研究BMP7基因突变在MRKH综合征中的致病性原因。研究方法:对442例MRKH综合征患者行全外显子测序,筛选出可能致病的BMP7突变位点。采用Sanger测序验证突变位点的真实性,然后通过细胞功能试验评估突变位点对BMP7基因在转录、翻译及功能水平的影响。再构建Bmp7flox/flox小鼠与在苗勒管不同部位表达的Cre工具小鼠繁育实现特异性敲除苗勒管不同部位组织的Bmp7基因观察其对小鼠苗勒管发育的影响。研究结果:1.在442例MRKH综合征患者的全外显子测序数据中筛选出10个BMP7基因可能致病的错义突变位点,分别是:c.52T＞G、c.461G＞A、c.496G＞A、c.713A＞G、c.865C＞T、c.866G＞A、c.941G＞A、c.1126C＞G、c.1244T＞A、c.1277G＞A。2.细胞实验发现突变位点c.52T＞G、c.713A＞G、c.865C＞T会导致BMP7总蛋白表达量降低;突变位点c.52T＞G、c.713A＞G也导致BMP7基因mRNA表达降低;另外,突变位点 c.52T＞G、c.461G＞A、c.496G＞A、c.713A＞G、c.865C＞T、c.1244T＞A导致BMP7蛋白分泌功能异常,BMP7蛋白分泌到细胞外的量降低,而位点c.866G＞A导致BMP7蛋白分泌到细胞外的量明显增多;蛋白定位实验发现位点c.52T＞G导致BMP7蛋白胞内定位异常,蛋白成颗粒状,与内质网的分布无明显重叠。3.在动物模型实验中 Bmp7flox/flox:Amhr2-Cre 雌性小 鼠和Bmp7flox/flox:Wnt7a-Cre雌性小鼠的生殖系统均无明显畸形表型。研究结论:通过对大样本生殖道畸形临床病例的测序及分析,筛查出可能致病的BMP7基因突变位点,然后在细胞水平对突变位点进行功能学验证,证明了部分BMP7基因突变位点在MRKH综合征中的致病性。为后续临床分子诊断检测提供了证据。