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目的构建低分子肝素修饰的pH响应雷公藤红素纳米粒PP/H NPs;并通过体内外实验考察其抗肿瘤转移的作用并初探其机制。方法1.低分子肝素修饰的pH响应纳米递药体系的合成与表征（1）采用酰胺化的化学反应合成高分子材料PEI-BM,并使用红外光谱及核磁共振氢谱对比相关特征峰验证材料接枝成功;（2）采用酰胺化的化学反应合成高分子材料PLGA-β-CD,并使用核磁共振氢谱对比相关特征峰验证材料接枝成功;（3）自组装形成PP NPs,包载雷公藤红素及二茂铁;以静电吸附作用修饰负电性的肝素（含烟酰胺）得到PP/H NPs;（4）采用马尔文粒径仪对PP/H NPs的粒径、粒径分布情况及Zeta电位进行表征;（5）采用超滤离心法及高效液相色谱对雷公藤红素在PP/HNPs中的包封率、载药量进行测定;（6）采用透射电镜对新鲜制备的PP/H NPs分别进行中性环境及低pH值环境下的形貌观测;（7）采用恒温水浴摇床及透析袋对新鲜制备的PP/H NPs于48 h内的体外释放情况进行表征。2.PP/HNPs的体外抗肿瘤活性及相关机制的初步探索（1）采用MTT法,分别检测不同浓度（10、50、100、200和500 ng/mL）游离雷公藤红素、PP NPs及PP/H NPs对鼠源三阴性乳腺癌4T1细胞活力的影响,并计算得到IC50值;（2）采用荧光共聚焦显微镜观察游离药物及两种纳米制剂的细胞摄取情况;（3）采用荧光共聚焦显微镜观察游离药物及两种纳米制剂在3D肿瘤球模型中的渗透情况;（4）采用细胞划痕实验研究游离药物及两种纳米制剂对4T1细胞横向迁移的影响;（5）采用Transwell小室评估游离药物及两种纳米制剂对4T1细胞纵向迁移的影响;并在此基础上,利用经Matrigel胶包被的Transwell小室评估游离药物及两种纳米制剂对4T1细胞体外侵袭的影响;（6）采用流式细胞仪及荧光共聚焦显微镜分析研究雷公藤红素与二茂铁及其纳米制剂对4T1细胞内ROS水平的影响;（7）构建4T1与3T3共培养模型,采用western blot及荧光共聚焦显微镜考察雷公藤红素及两种纳米制剂对肿瘤相关成纤维细胞激活蛋白α-SMA蛋白表达的影响。3.PP/HNPs的体内抗肿瘤活性及抗肿瘤肺转移的初步研究（1）构建BALB/C雌小鼠原位乳腺癌肺转移模型,尾静脉注射游离雷公藤红素及两种纳米制剂,考察抗肿瘤的活性;（2）通过H＆E染色,观察肺转移情况并评价PP/H NPs体内抑制乳腺癌肺转移的作用;（3）通过免疫荧光法考察肿瘤组织中的α-SMA和collagen I表达情况。结果1.低分子肝素修饰的pH响应纳米递药体系的合成与表征利用马尔文粒径仪测得新鲜制备的PP/H NPs的粒径为108.37±1.02 nm,多分散系数PDI为0.15±0.01,zeta电位为（-32.47±1.06）mV。雷公藤红素的包封率及载药量分别为98.56%和3.08%,在pH＜6.0时体现pH响应体外释放。TEM观察到PP/H NPs类圆形且外层肝素层清晰可见。2.PP/HNPs的体外抗肿瘤活性及相关机制的初步探索MTT实验显示,雷公藤红素、PP NPs及PP/H NPs对4T1细胞都具有细胞毒性,PP/HNPs的细胞毒性最强（IC50=20.33±1.51 ng/mL）。细胞摄取实验显示纳米制剂较游离药物细胞摄取更高。3D肿瘤球药物渗透实验则显示,肝素层的烟酰胺可能存在的降低肿瘤间质液压的作用可明显使内核中的药物深入渗透至肿瘤球深处。体外抗转移相关实验从横向及纵向两个方面证实PP/HNPs的抗转移作用最强,其划痕愈合率高达99.5%,迁移率和侵袭率分别低至20.6%和8.7%。细胞内ROS水平的考察则显示,雷公藤红素具有促进4T1细胞内ROS生成的作用,一定浓度范围的二茂铁可与雷公藤红素形成协同促进ROS生成的作用,含有两种药物的PP NPs产ROS能力最强。4T1与3T3共培养模型中,3T3/4T1细胞明显较3T3细胞更为细长,纤维化更明显。而western blot及激光共聚焦显微镜结果显示,PP/HNPs组中的肿瘤相关成纤维细胞生成的标志性蛋白α-SMA蛋白表达明显较其他组别低。3.PP/HNPs的体内抗肿瘤活性及抗肿瘤肺转移的初步研究实验结果显示,BALB/C小鼠原位乳腺癌肺转移模型构建成功。小鼠处死后发现,PP/H NPs组较其他给药组和非给药组小鼠体重变化比较稳定;肿瘤体积明显偏小,抑瘤率高达65.9%;H＆E染色图片及肺部实物照片显示,PP/HNPs组肺转移结节几乎不可见。免疫荧光结果显示,肿瘤组织中α-SMA和Collagen I的表达有明显的抑制作用。结论本课题中自组装制备的低分子肝素修饰的pH响应纳米递药体系PP/H NPs粒径均一分散,呈类圆形分布于水相中。低pH值诱发BM-β-CD分子开关打开,纳米粒解体,核内的雷公藤红素及二茂铁释放至细胞质中。体内外实验相继验证,PP/H NPs具有很强的细胞毒性,并且可有效抑制肿瘤转移。其中雷公藤红素促进4T1细胞内的ROS水平升高,二茂铁则催化细胞中本身存在的过氧化氢经过芬顿反应产生毒性较强的羟自由基。二者协同作用,一方面产生的羟自由基可直接损伤肿瘤细胞的DNA、使脂质过氧化并使蛋白质中氨基酸发生氧化,促进肿瘤细胞凋亡和转移。此外,PP/H NPs明显抑制肿瘤相关成纤维细胞的产生,降低细胞间质相关蛋白的表达,同样起到抑制肿瘤转移的作用。综上所述,PP/H NPs在改善中药单体雷公藤红素水溶性差、毒副作用高的基础上,可通过定点释放药物,调节肿瘤微环境及细胞内活性氧的水平,有效抑制肿瘤细胞转移并促进细胞死亡。