论文部分内容阅读
[目 的]背根神经节(DRG)中的卫星胶质细胞(SGCs)具有多向分化的潜能。前期通过测序和生信分析发现:SGCs转分化为神经元表型的过程中差异表达的lncRNAENSRNOT00000087717及其靶向调控因子AKT1可能参与DRG-SGCs转分化过程。基于前期的发现,从该lncRNA与PI3K/AKT信号通路的调控关系出发,探讨lncRNAENSRNOT00000087717在DRG-SGCs转分化为神经元样细胞过程中,以及其在坐骨神经损伤大鼠神经修复中的作用和机制,为外周神经发育及损伤修复研究提供新的思路和实验基础。[方法]通过体外培养大鼠DRG-SGCs,给与浓度为4 ug/ml的Anti-proBDNF进行诱导干预,然后分别分组为 SGC、Anti-proBDNF24h、Anti-proBDNF3d、Anti-proBDNF7d、Anti-proBDNF14d 5 个组,RT-qPCR 实验验证 lncRNA ENSRNOT00000087717在以上5个组中的表达变化与测序结果的一致性;在Anti-proBDNF诱导DRG-SGCs转分化过程中,构建慢病毒载体干扰DRG-SGCs中的lncRNA ENSRNOT00000087717;分别使用AKT1抑制剂和激动剂干扰PI3K/AKT信号通路。RT-qPCR检测DRG-SGCs转分化过程中lncRNA ENSRNOT00000087717、AKT1 和 PI3K/AKT 信号通路关键因子(BDNF,TrkB,PI3K,proBDNF,p75NTR)的表达变化,免疫荧光细胞化学技术鉴定体外培养的DRG-SGCs 形态。通过建立SD大鼠坐骨神经损伤模型,损伤后腹腔注射浓度为4ug/ml的Anti-proBDNF进行诱导干预,将SD大鼠随机分为对照组(生理盐水组)、Anti-proBDNF24h 组、Anti-proBDNF3d 组、Anti-proBDNF7d 组、Anti-proBDNF14d组、Anti-proBDNF21d组。待到干预时间点后取大鼠脊髓腰段第4-6节段(L4-L6)DRG,进行 RT-qPCR 实验,检测 IncRNA ENSRNOT00000087717、AKT1、BDNF、TrkB、p75NTR、proBDNF的表达变化。分别使用AKT1抑制剂和激动剂干扰PI3K/AKT 信号通路,RT-qPCR 检测 DRG 中 lncRNAENSRNOT00000087717、AKT1和PI3K/AKT信号通路关键因子(Bad,PDK1,PI3K,NF-κB)的表达量,免疫荧光组织化学技术鉴定DRG冰冻切片中的细胞形态,TUNEL检测DRG组织切片中的细胞凋亡情况。[结 果]1.本研究通过lncRNA测序和生信分析发现SGCs转分化为神经元表型的过程中差异表达的lncRNAENSRNOT00000087717显著上调,KEGG和GO分析富集到PI3K/AKT信号通路,lncRNA-mRNA共表达网络分析发现lncRNA ENSRNOT00000087717靶向基因为AKT1,且相关性系数较高,推测AKT1可能为lncRNAENSRNOT00000087717的靶基因之一,参与调控DRG-SGCs转分化为神经元样细胞的过程;2.形态观察和免疫荧光细胞化学实验鉴定体外培养细胞为DRG-SGCs;3.DRG-SGCs传代后经Anti-proBDNF干预诱导后SGCs表达神经干细胞的相关特性(Nestin免疫荧光标记阳性);4.RT-qPCR结果显示,Anti-proBDNF诱导DRG-SGCs转分化过程中,lncRNAENSRNOT00000087717 和 AKT1 在 DRG-SGCs 转分化 3 天和 14 天时表达量与对照组相比显著上调(p<0.05),与测序结果一致,但DRG-SGCs转分化7天组与对照组相比lncRNAENSRNOT00000087717表达量有下降趋势;5.使用lncRNA荧光原位杂交技术(FISH)检测了 lncRNA ENSRNOT00000087717 的亚细 胞定位,结果显 示 lncRNA ENSRNOT00000087717主要定位于SGCs细胞质中;6.Anti-proBDNF 诱导 DRG-SGCs 转分化 3 天后,干扰 lncRNA ENSRNOT00000087717,RT-qPCR 检测 lncRNAENSRNOT00000087717 和 AKT1表达水平,结果显示与对照组相比AKT1表达量显著下降(P<0.01);AKT1抑制或激活后,lncRNAENSRNOT00000087717和AKT1表达量变化一致,激活AKT1 后 lncRNAENSRNOT00000087717 表达量上调(P<0.05),抑制 AKT1 后lncRNAENSRNOT00000087717表达量下调(P<0.05);免疫荧光细胞化学实验结果显示激活AKT1组可见Nestin阳性的SGCs突起增加;7.坐骨神经损伤大鼠模型腹腔注射Anti-proBDNF后,干预24h、3d、7d、14d、21d 五个时间点中 3 天组 DRG 中 lncRNAENSRNOT00000087717、AKT1、BDNF、TrkB、p75NTR 的表达上调(p<0.05,p<0.01),proBDNF 的表达显著下调(p<0.01);8.坐骨神经损伤后Anti-proBDNF干扰并激活AKT1 3天组的大鼠DRG中检测到GS免疫荧光阳性细胞;且AKT1和lncRNAENSRNOT00000087717表达与对照组相比均显著上调(p<0.01),PI3K、PDK1、NF-κB、Bad表达均显著下调(p<0.01);TUNEL检测结果表明抑制AKT1后DRG中细胞凋亡数量与对照组相比有所增加(P<0.05)。[结 论]1.lncRNAENSRNOT00000087717 定位于 SGCs 细胞质中,SGCs 在转分化为神经元样细胞的过程中lncRNAENSRNOT00000087717和AKT1高表达;2.lncRNA ENSRNOT00000087717 靶向调控 AKT1,敲低 lncRNA ENSRNOT00000087717抑制DRG-SGCs向神经元样细胞的转分化,抑制AKT1后DRG中细胞凋亡数量明显增加。