研究背景前列腺癌（Prostate Cancer）是西方国家最常见的男性恶性肿瘤,也是男性癌症死亡的第二大原因。炎症与前列腺癌发病机制密切相关,越来越多的证据表明,炎症环境和肿瘤细胞可以产生各种不同类型的炎症因子,例如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α,TNFα）可以促进下游致癌核因子κB（Nuclear factorκB,NF-κB）和癌细胞生存。鉴于炎症在前列腺癌发育和进展中的重要性,调节NF-κB激活的信号通路一直是前列腺癌的化学预防和治疗过程中极具吸引力的目标。目前已经有多项以炎症抑制为基础的肿瘤治疗方案正在临床试验中,但是结果不尽如人意,这也提示了深入探究炎症参与到前列腺癌作用机制的重要性。MAP3K7是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,也被称为TGF-β活性激酶1（TGF-β activated kinase 1,TAK1）。MAP3K7是MAP激酶信号通路的重要组成部分,被认为是炎症信号通路中的关键调控分子之一。MAP3K7可以被包括TNFα,TGF-β和脂质糖（LPS）等细胞因子激活,在这些细胞因子的刺激下,MAP3K7可以与 TAK1 结合蛋白 1（TAK1 bindingprotein 1,TAB1）、TAK1 结合蛋白 2（TAK1 binding protein 2,TAB2）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）等形成复合物,激活κB 抑制物（κB inhibitor,IκB）激酶（Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK）及其下游 NF-κB 通路。IKK复合物包含IKKα和IKKβ两个催化亚基以及一个调节亚单位IKKγ（也称为NEMO）。在炎症刺激性细胞因子（如TNFα）的刺激下,IKK被磷酸化激活并介导磷酸化依赖的底物IκB的多聚泛素化和降解。IκB的降解是NF-κB通路激活的关键步骤。最近的研究表明,除了IκB,IKK同样可以磷酸化其它与癌症有关的蛋白质,包括BAD,FOXO3,BCL-10和A20等,并促进这些蛋白质的泛素化降解。因此,MAP3K7通路不仅在介导炎症方面发挥了重要作用,在肿瘤的调节过程中也占据了重要的地位。值得注意的是,MAP3K7基因也与人类前列腺癌密切相关,MAP3K7基因在10%以上的前列腺癌患者中存在显著的缺失。然而,MAP3K7缺失在前列腺癌发病机制中的确切作用在很大程度上仍不清楚。因此,探究MAP3K7参与到前列腺癌过程中的详细作用机制对于前列腺癌的预防和治疗将起到非常重要的作用。雄激素受体（Androgen Receptor,AR）是类固醇激素核受体家族的一员,在前列腺癌的启动和进展中起着至关重要的作用。目前靶向AR的治疗一直都是前列腺癌的一线主流治疗手段。作为前列腺癌的关键调控靶点,调控AR水平的所有可能机制都是前列腺癌治疗的重要研究领域。AR蛋白水平及其活性由翻译后修饰精确调节,包括磷酸化、乙酰化、SUMO化、甲基化和泛素化等。与其它转录因子类似,AR蛋白受泛素蛋白酶体通路的严格调节。目前已知的E3泛素连接酶包括了 MDM2、C-终端HSP相互作用蛋白（C-terminal HSP interacting protein,CHIP）和Siah等,它们在不同的条件下参与调控了 AR的稳定性和活性。在本研究中,课题组对前列腺癌患者前列腺组织的IHC结果分析时发现了炎症区域AR水平显著下降的现象。结合相关背景和课题组前期研究进一步证实了促炎细胞因子TNFα诱导AR蛋白多聚泛素化和蛋白酶体降解。为进一步研究TNFα抑制AR的相关机制,课题组构建了前列腺特异性Map3k7基因敲除小鼠,证明了Map3k7的缺失增加了小鼠前列腺中Ar蛋白的水平和活性。同时也通过一系列分子实验明确了 MAP3K7是介导TNFα抑制AR的关键靶点。为进一步明确相关机制,课题组探究并发现了 MAP3K7的下游分子IKKβ可以直接结合并影响AR蛋白的泛素化降解。鉴于IKKβ可以磷酸化底物并介导底物的泛素化降解,课题组通过分析AR蛋白序列发现了 AR蛋白序列中存在的IKKβ和β-TRCP经典的底物结合域,并确定了β-TRCP是AR直接的泛素化连接酶。同时,课题组也在动物体内实验中证实了 MAP3K7的缺失及ARS298A/302A突变会显著促进移植瘤的形成。阻断AR降解可增强AR活性和前列腺癌细胞在体外和炎症条件下的生长。本次研究通过探究MAP3K7-IKKβ炎症信号通路介导炎症抑制AR表达,发现了 MAP3K7抑制前列腺癌的新机制,并首次明确了 IKKβ介导的β-TRCP2对AR的降解过程。同时这一研究也丰富了我们对前列腺炎症与前列腺癌之间关系的理解,为前列腺癌的预防和治疗提供了新的思路和方案。第一部分:TNFα炎症因子对AR的表达抑制研究目的1.探究前列腺炎症对AR表达的影响;2.明确TNFα对AR蛋白水平表达的抑制作用。方法1.前列腺癌组织标本收集:在医学伦理委员会的批准下,收集了于2010年至2018年医学中心就诊的部分前列腺癌患者的前列腺癌组织标本。2.免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测非炎症组织（Non-inflammation）,炎症周围区域（Inflammation-adj）及炎症区域（Inflammation）AR蛋白的表达水平;3.采用Western blot技术检测处理不同浓度或者不处理TNFα之后以及同时处理或不处理MG132情况下AR蛋白的表达水平;4.Co-IP检测处理不同浓度或者不处理TNFα情况下,AR蛋白的泛素化水平的变化;5.采用Western blot技术检测处理或者不处理TNFα情况下,AR蛋白的半衰期变化。结果1.IHC结果表明,与非炎症组织和炎症周围区域相比,炎症区域的AR蛋白水平显著下降（P＜0.05）;2.在LNCaP和LAPC-4细胞中,AR蛋白水平随着TNFα处理浓度的升高而不断下降,TNFα抑制AR蛋白表达水平能被MG132所阻断（P＜0.05）;3.AR蛋白的泛素化水平随着TNFα处理浓度的升高而不断上升（P＜0.05）;4.TNFα处理可以缩短AR蛋白的半衰期（P＜0.05）。小结TNFα通过促进AR蛋白的泛素化来抑制AR蛋白的稳定性。第二部分:MAP3K7缺失促进AR的表达并促进肿瘤的进展研究目的1.探究前列腺组织特异MAP3K7缺失转基因小鼠模型中AR及其下游分子的表达水平;2.探究前列腺癌患者组织中MAP3K7与AR之间的关联;3.明确MAP3K7对AR表达水平的调控。方法1.构建前列腺组织特异性Pb-Cre+;Map3k7（Tak1）loxp/loxp（Map3k7P/P）小鼠模型,通过IHC对比Map3k7缺陷小鼠与对照组小鼠之间Ar蛋白的表达,通过qRT-PCR对比Map3k7缺陷小鼠与对照组小鼠之间AR及AR下游基因之间的表达;2.构建基于Pb-Cre+;Map3k7P/P转基因小鼠及对照组小鼠的类器官组织（Organoid）,并采用免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）对比Map3k7 缺陷小鼠与对照组小鼠类器官之间AR蛋白的表达。3.采用Western blot技术检测敲低MAP3K7的同时处理或者不处理TNFα之后AR蛋白水平的表达变化;4.IHC检验前列腺癌患者前列腺癌组织中MAP3K7蛋白与AR蛋白表达水平之间的关系;5.构建稳定敲低MAP3K7/AR或者共同敲低MAP3K7和AR的C4-2细胞系,注射至免疫缺陷鼠皮下构建体外移植瘤。对照不同分组小鼠移植瘤的大小,qRT-PCR检测不同分组移植瘤组织AR及其下游基因的表达水平。结果1.Map3k7缺陷小鼠前列腺组织虽然未出现显著的肿瘤或者前列腺上皮内瘤变（Prostate intraepithelial neoplasia,PIN）,但是可以看到显著的增生性病变,同时Map3k7缺陷小鼠前列腺组织中AR的蛋白水平出现了显著的上升,而且AR下游基因的表达也出现了显著的上升（P＜0.05）;2.相比于对照组小鼠,Map3k7缺陷小鼠的类器官中AR的蛋白水平同样显著的上升（P＜0.05）;3.敲低MAP3K7之后AR蛋白的表达水平显著的上升,而且对MAP3K7的敲除可以阻断TNFα对AR蛋白水平的影响,差异具有统计学意义（P＜0.05）;4.前列腺癌患者前列腺癌组织中MAP3K7蛋白与AR蛋白表达水平之间存在显著的负相关（P＜0.05）;5.敲低MAP3K7显著促进前列腺癌细胞的生长,敲除AR之后可以逆转这种促进肿瘤细胞生长的效果（P＜0.05）;同样在体内水平中敲除MAP3K7也可以促进免疫缺陷鼠体外移植瘤的生长,而这种促肿瘤效果也可以通过敲除AR实现逆转（P＜0.05）;6.敲低MAP3K7组移植瘤中AR下游基因KLK3,NKX3.1,TMPRSS2表达水平都显著上升,这些变化都可以被敲除AR所逆转（P＜0.05）;小结MAP3K7可以抑制AR蛋白表达水平,MAP3K7的缺失会阻断TNFα对AR蛋白表达水平的抑制。第三部分:IKKβ促进AR蛋白的泛素化水平并抑制AR蛋白表达水平研究目的1.探究IKKβ是否通过调控AR蛋白的泛素化水平抑制AR蛋白表达水平;2.探究IKKβ是否参与到了 TNFα调控AR通路。方法1.采用Western blot技术检测敲低IKKβ之后同时处理或不处理MG132的情况下AR蛋白表达水平的变化;2.采用Western blot技术检测IKKβ功能缺陷突变对AR蛋白表达水平的影响;3.采用Western blot技术检测使用IKKβ抑制剂wedelolactone对TNFα抑制AR蛋白表达的影响;4.Co-IP检测IKKβ功能缺陷突变,敲低IKKβ及使用IKKβ抑制剂wedelolactone对AR蛋白泛素化水平的影响;5.采用Western blot技术检测敲低IKKβ对AR蛋白半衰期的影响;结果1.敲低KKβ后,AR蛋白水平显著上升,且这种抑制作用可以被MG132所阻断（P＜0.05）;2.与IKKβ野生型相比,IKKβ功能缺陷突变型无法抑制AR蛋白的表达（P＜0.05）;3.IKKβ抑制剂wedelolactone可以阻断TNFα抑制AR蛋白的效果;4.与IKKβ野生型相比,IKKβ功能缺陷突变型无法提高AR蛋白的泛素化水平;而敲低IKKβ及IKKβ抑制剂wedelolactone使AR蛋白的泛素化水平显著下降（P＜0.05）;5.敲低IKKβ可以显著延长AR蛋白的半衰期（P＜0.05）。小结IKKβ可以抑制AR的泛素化水平抑制AR蛋白水平的表达。第四部分:IKKβ介导β-TRCP2对AR的泛素化降解研究目的1.探究β-TRCP2对AR泛素化降解的详细机制;2.探究IKKβ参与β-TRCP2调控AR泛素化的机制。方法1.对比寻找AR蛋白序列中是否存在β-TRCP底物经典识别域;2.采用Western blot技术检测β-TRCP1和β-TRCP2野生型及其F-box功能域缺失突变型对AR蛋白水平的影响;3.采用Western blot技术检测TNFα和IKKβ对β-TRCP2调控AR蛋白水平过程的影响;4.Co-IP检测敲低β-TRCP2同时敲低或者不敲低IKKβ对AR蛋白泛素化的影响;5.Co-IP对比β-TRCP2野生型及其F-box功能域缺失突变型对AR蛋白泛素化水平的影响;6.采用Western blot技术检测敲低β-TRCP2对AR半衰期的影响;7.根据预测分别构建AR蛋白S158A/S162A和S298A/S302A突变,并采用 Western blot 技术检测 S158A/S162A 和 S298A/S302A 突变对β-TRCP2 降解 AR的作用;采用Co-IP检测S158A/S162A和S298A/S302A突变对β-TRCP2增加AR蛋白泛素化的影响;8.采用 Western blot 技术检测 S158A/S162A 和 S298A/S302A 突变对 AR 蛋白半衰期的影响;9.荧光素酶实验验证敲低IKKβ和/或敲低β-TRCP2对AR下游基因PSA和ARE的影响;10.qRT-PCR检测敲低IKKβ和/或敲低β-TRCP2对AR下游基因KLK3,NKX3.1,KLK2和TMPRSS2表达的影响;11.MTS实验验证在TNFα作用情况下,AR野生型及S158A/S162A和S298A/S302A突变型对前列腺癌细胞生长的促进作用;12.构建对照组,过表达野生型AR组和过表达S298A/S302A突变型AR三组稳转细胞株并皮下注射至免疫缺陷小鼠皮下,27天后对照移植瘤大小;结果1.AR序列中存在两个显著的β-TRCP底物经典识别域;2.过表达β-TRCP1和β-TRCP2野生型可以抑制AR蛋白的表达（P＜0.05）,β-TRCP1和β-TRCP2 F-box功能域缺失突变型对AR蛋白水平则无显著影响;3.敲低β-TRCP2后阻断了 TNFα和IKKβ对AR的抑制作用（P＜0.05）;4.敲低β-TRCP2可以显著降低AR蛋白的泛素化水平（P＜0.05）;5.与β-TRCP2野生型相比,β-TRCP2 F-box功能域缺失突变型不能抑制AR蛋白的泛素化水平（P＜0.05）;6.敲低β-TRCP2后,AR蛋白的半衰期显著延长（P＜0.05）。7.AR S298A/S302A突变可以抑制β-TRCP2对AR蛋白的泛素化提高和抑制AR蛋白表达的作用,而S158A/S162A没有效果,差异具有统计学意义（P＜0.05）;8.AR S298A/S302A突变而非S158A/S162A突变可以延长AR的半衰期（P＜0.05）;9.敲低IKKβ和β-TRCP2可以促进AR下游基因的表达（P＜0.05）;10.AR S298A/S302A突变而非S158A/S162A突变可以抵抗TNFα对前列腺癌细胞的杀伤作用;在TNFα作用下,AR S298A/S302A突变稳转细胞株在小鼠体内成瘤速度更快（P＜0.05）。小结β-TRCP2是AR的泛素化连接酶并参与到了 TNFα-MAP3K7-IKKβ通路调控AR的通路中,ARDSAGKS序列是IKKβ和β-TRCP2作用于AR的具体靶点。