背景:随着经济技术水平的不断提高,电离辐射已经完全充满了人们的日常生活。微小RNA(micro RNA,mi RNA)已经被发现在不同类型的辐射损伤中呈差异表达状态。有研究发现mi R-147a是放射损伤后的一个重要差异表达基因,它可以促使正常细胞发生凋亡导致辐射损伤的敏感性。PDPK1介导AKT的磷酸化,PI3K/PDPK1/AKT信号通路在辐射损伤的防护中起着重要作用,辐射后mi R-147a与PDPK1有相反关系。目的:研究mi R-147a与PDPK1之间的靶标关系,为下一步探讨mi R-147a和PDPK1基因在辐射致癌发展过程提供实验基础。方法:利用生物信息学软件Target Scan,mi Randa数据库,预测mi R-147a调控PDPK1基因结合序列。设计合成PDPK1 3’-UTR目的基因片段,将目的基因片段克隆到GV272荧光素酶报告基因载体,通过T4连接酶反应构建PDPK1 3’-UTR双荧光素酶报告基因野生型载体(GV272-PDPK1 3’-UTR)以及突变型载体(GV272-PDPK13’-UTR-mut);另外将mi R-147a PCR扩增片段和GV268荧光素酶报告基因载体相连,通过交换被交换反应构建GV268-mi R-147a重组载体。基因测序鉴定重组载体,验证重组载体构建成功。使用转染试剂Lipofectamine TM 2000 Reagent将这两种重组载体质粒共转染到293T细胞中,然后利用双荧光素酶基因检测系统检测其活性,以及利用western blot和荧光定量PCR验证二者相互关系,进而确定mi R-147a与PDPK1是否具有直接调控作用。结果:PCR基因测序结果表明,PCR扩增后含有PDPK1 3’-UTR和PDPK1 3’-UTR序列的片段的大小和序列与Gene Bank的报道序列一致。成功构建了两个含有mi R-147a结合位点的重组质粒及其突变重组质粒。双荧光素酶报告基因测定结果表明,与用PDPK1 3’-UTR突变载体质粒转染的mi R-147a组相比,荧光素酶活性与阴性对照组相比没有显着差异。通过转染PDPK1 3’-UTR载体,mi R-147a组荧光素酶的活性被明显抑制。荧光素酶活性与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)。在western、PCR、荧光显微镜验证PDPK1与mi R-147a的表达的实验中,mi R-147a组与阴性对照组相比表达量减少,具有显著性差异(P<0.05);而加过抑制剂后,mi R-147a组表达量增多,具有显著性差异(P<0.05)。结论:成功构建两组重组载体;PDPK1基因是mi R-147a的靶基因,mi R-147a结合到PDPK1基因的3’-UTR区域,mi R-147a和PDPK1具有负性调控表达,mi R-147a对转录后水平的PDPK1基因具有直接抑制作用。