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乳腺癌不但是女性最常见的恶性肿瘤,也是女性因癌死亡的头号杀手。虽然传统的手术治疗、放疗、化疗和内分泌治疗已经广泛应用于临床,但仍有肿瘤复发与转移的发生。近年来,随着肿瘤免疫逃逸机制在肿瘤发生、发展认识的加深,以及机体内环境参与免疫监视和免疫杀伤的效应性免疫细胞、细胞因子以及表面分子认识的加深,人们对于乳腺癌肿瘤免疫治疗的探讨成为该领域前沿课题。我们前期的研究中发现乳腺癌患者的外周血中,Th9细胞的百分率及CD4+T细胞表面OX40分子的表达均低于乳腺良性纤维腺瘤和健康志愿者。Th9细胞相对其他的CD4+T细胞亚群具有特异性的抑瘤作用;属于肿瘤坏死因子受体超家族（Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily,TNFR）的 OX40 分子及其信号是促进活化T细胞的增殖、分化以及记忆性T细胞长期存活的重要共刺激信号。本课题以促进免疫应答的正性共刺激分子OX40及其信号为切入点,以Th9细胞诱导分化为主线,借助免疫学、细胞生物学、动物学、组织病理学等手段,探讨OX40分子及其信号在Th9细胞分化以及乳腺癌肿瘤免疫治疗中的作用及可能机制。论文第一部分采用流式细胞术、Real-time PCR技术以及CD4+T细胞与小鼠乳腺癌细胞株4T1共育实验等方法检测了 OX40信号激发后对Th9细胞诱导分化中特异性细胞因子IL-9的分泌、转录因子PU.1的表达以及对乳腺癌细胞株4T1的杀伤效应。研究结果发现:（1）42h,25ng/ml rhOX40L激发OX40信号可诱导高水平Th9细胞,差异均具有显著统计学意义（P＜0.0001;P＜0.0001）;（2）在最佳诱导条件下,OX40信号的激发可以显著上调IL-9、PU.1的蛋白表达水平（P＜0.0001;P＜0.0001）;有效上调 IL-9、PU.1 的 mRNA 水平（P＜0.0001;P=0.019）;（3）CD4+T细胞杀伤能力实验显示,OX40信号可显著上调穿孔素的表达,差异具有显著统计学意义（P＜0.0001）;Th9细胞与4T1乳腺癌直接共育与间接共育实验显示,OX40信号的激活可显著抑制肿瘤的增殖（P=0.0454;P=0.0274）并诱导肿瘤细胞早期凋亡（P=0.0001）。论文第二部分利用Real-time PCR技术及分析TRAF6基因敲除后的影响,研究分析OX40信号激发及阻断后相关信号分子、转录因子的表达情况,探讨OX40信号对Th9细胞诱导分化可能的调节机制和信号通路以及对免疫应答的影响。研究结果发现:（1）Real-time PCR技术检测结果显示OX40信号激发相对未激发组可在12h上调TRAF6基因mRNA的表达水平（P=0.0427）,24h上调PU.1和 BATF 的 mRNA 表达（P=0.0019、P=0.023）;（2）TRAF6 基因敲除可导致Th9细胞分化受阻及转录因子PU.1蛋白水平下降（P=0.0011、P=0.0163）;（3）OX40信号的激发相对未激发组可明显促进TEM 比例的增加（P=0.0012）,但对TCM的促进并不明显（P=0.1488）,但能促进TEM和TCM分泌较高水平的IL-9（P＜0.0001;P＜0.0001）;（4）TRAF6基因的敲除可影响TEM的形成,差异具有统计学意义（P=0.0082）。论文第三部分利用原位乳腺癌动物模型分析探讨OX40信号所激发的CD4+T细胞对4T1荷瘤小鼠过继免疫治疗效果;利用全基因测序分析OX40信号激发与否与Th9细胞分化及功能相关基因的变化。研究结果发现:（1）OX40激发治疗组中荷瘤小鼠的肿瘤生长受到抑制（P=0.0370;P=0.0382）;（2）相对Th0治疗组及Th9治疗组,OX40激发治疗组中IL-9、IL-21、IFN-γ及IL-4的分泌表达上调（P=0.0343;P=0.0164;P=0.0048;P=0.0006）,而下调 IL-17 的分泌（P=0.0427）;（3）OX40激发治疗组中荷瘤小鼠体内CD4+T细胞的百分率高于Th0治疗组及Th9治疗组（P=0.0218）,且其表面负性共刺激分子PD-1及Tregs转录因子Foxp3呈下调表达（P=0.0057;P=0.0052）;（4）OX40激发治疗组中NK细胞和TEM的百分率均明显升高（P=0.0179;P=0.0227）;而B细胞的百分率则下降（P=0.0048）;（5）转录组测序结果显示,OX40信号可上调Th9细胞相关IL-9、IL-21等细胞因子以及穿孔素等功能分子。综上,OX40信号的激发可通过蛋白和基因水平上调细胞因子IL-9、转录因子PU.1的表达而诱导Th9细胞分化;同时OX40信号的激发还可增强Th9细胞分泌穿孔素,从直接和间接方式上抑制乳腺癌细胞株4T1增殖、诱导其早期凋亡;OX40信号还可明显促进TEM比例的增加并显著促进TEM、TCM分泌高水平的IL-9;TRAF6基因敲除实验证实OX40信号的阻断可减少IL-9分泌、下调转录因子PU.1的表达进而影响Th9细胞分化;TRAF6基因敲除实验还证实Th9细胞分化过程中OX40-TRAF6-PU.1通路的存在以及TEM的形成受到影响;全基因组测序结果证实OX40信号的激发可上调Th9细胞相关细胞因子及功能相关分子。此外,体内实验证实,OX40信号激发的非肿瘤特异性过继免疫治疗可抑制肿瘤的生长,并分泌较高水平IL-9、IL-21等Th9细胞相关细胞因子并下调CD4+T细胞表面PD-1分子及Tregs转录因子Foxp3的表达;上述体内外实验为OX40信号介导Th9细胞在乳腺癌过继免疫治疗以及Th9细胞进行分子生物学改造提供了新的思路。