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鳗弧菌是危害我国水产养殖业的重要鱼类致病菌,可由黏膜组织进入鱼体。随着集约化养殖模式兴起,由机械损伤、寄生虫叮咬和肠炎等造成的黏膜损伤时有发生。目前,尚未有关于黏膜损伤对鳗弧菌感染影响的详细报道。本研究首先利用qPCR技术考察了野生型致病性鳗弧菌MVM425浸泡感染斑马鱼后在黏膜组织处的定植情况,该菌可在肠道和皮肤中停留数小时并在皮肤中大量增殖。研究随后建立皮肤和肠黏膜层损伤模型,考察了自然环境下黏膜损伤对鳗弧菌感染的影响。结果显示,MVM425浸泡感染健康、皮肤和肠黏膜层受损斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为106、103和106CFU/ml。利用免疫组化技术和qPCR技术进一步证实,皮肤黏膜层受损后,鳗弧菌可由皮肤损伤处突破鱼体皮肤屏障,进而迅速增殖并导致内脏出血,引起斑马鱼出现系统性弧菌病症状。因此,养殖过程中避免黏膜损伤尤其是皮肤黏膜层损伤对预防弧菌病十分重要。接种疫苗是预防弧菌病暴发的有效手段之一。本实验室利用无标记基因缺失技术成功构建鳗弧菌减毒活疫苗MVAV6203,该菌浸泡接种大菱鲆和牙鲆可获得良好免疫保护效果,但对其浸泡接种的进入途径及其能否激发黏膜免疫应答尚不了解。本研究首先利用qPCR技术和透射电镜技术考察了疫苗浸泡接种后在斑马鱼各黏膜组织处的定植情况,疫苗在鳃组织中被迅速清除,在皮肤和肠道中可大量增殖,且在肠道中存留时间较久。电镜结果显示,鳃组织中仅0h时可见极少量疫苗菌体结构,皮肤黏膜层中3h时可见MVAV6203零星分布,而肠道中72h时仍可见MVAV6203样细胞结构存在。对黏膜组织免疫应答相关基因进行考察,各黏膜组织均可依靠TLR5识别MVAV6203鞭毛结构,接种12h时肠道、皮肤和鳃组织中TLR5表达量分别上调4.7倍、7.4倍和3.8倍。此外,肠道中识别脂蛋白和脂多糖的TLR2和TLR4分别于接种24和48h上调表达1.3和1.6倍,并开启MyD88依赖的信号通路,释放IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a等细胞因子。病理分析证实接种后肠组织产生轻微炎症反应,上皮内淋巴细胞数量自接种后6h显著增加。因此,肠道是MVAV6203进入斑马鱼鱼体及黏膜免疫应答激发的主要场所。MVAV6203浸泡免疫初期可由斑马鱼黏膜组织进入鱼体并激发黏膜免疫应答,但其激发局部免疫与系统免疫的应答过程及二者联系尚不清楚。本研究利用RT-qPCR技术考察了MVAV6203浸泡接种后激发斑马鱼局部黏膜组织及系统免疫器官的免疫应答过程及效应。免疫初期疫苗可刺激肾脏吞噬细胞增殖并表达TLR5,接种3d时TLR5和吞噬细胞细胞标志物b7r分别上调4.5倍和5.7倍,吞噬细胞随后经血液循环到达黏膜组织处行使识别和吞噬抗原功能,接种21d时皮肤TLR5和b7r表达量分别上调1.9倍和3.3倍。此外,脾脏和肾脏中MHC分子表达量在接种3d时分别上调1.7倍和5.5倍,肠道中MHC分子在接种7d时上调表达1.7倍,免疫接种21d时皮肤中MHC分子及CD4、CD8表达量均上调显著,推测免疫细胞由系统免疫器官迁移至局部黏膜组织行使抗原递呈功能。与Th1、Th2、Thl7和Threg分化相关的细胞因子及转录调控因子分别于接种3d和14～21d在肾脏和皮肤、肠道中上调表达,说明分化成熟的T淋巴细胞先后迁移至系统免疫器官和局部黏膜组织行使细胞介导的免疫应答反应。此外,疫苗接种可快速激活黏膜抗体IgZ介导的体液免疫应答,免疫后期肾脏中IgM大量表达行使系统抗体介导的体液免疫应答功能。因此,疫苗可激发局部免疫与系统免疫,且二者间存在免疫组分迁移现象。经浸泡和注射接种方式接种MVAV6203的鱼体均可获得良好免疫保护效果,但对两种接种方式激发的免疫应答过程尚不了解。本研究对比分析了疫苗以不同方式接种斑马鱼后激发免疫系统的应答过程。疫苗接种后均可在短时间内激活免疫细胞对抗原的识别和递呈过程,并最终增强免疫系统非特异性及特异性免疫防御能力,但注射方式较浸泡方式可更早产生细胞介导的免疫效应；两种接种方式均可在短时间内激活抗体介导的体液免疫并最终产生系统抗体在黏膜组织处及黏膜抗体在系统免疫器官中介导的免疫效应,仅免疫效应的时相存在差别,证实不同免疫策略可收获相似的效应,为评价疫苗免疫效果奠定理论基础。除鳗弧菌外,迟钝爱德华氏菌是又一危害我国水产养殖业的鱼类致病菌。实验室前期工作证实,经高浓度迟钝爱德华氏菌菌液浸泡的斑马鱼不易感,但黏膜损伤对该菌感染鱼体的影响尚不清楚。本研究考察了黏膜损伤对迟钝爱德华氏菌EIB202感染斑马鱼的影响。结果显示,EIB202感染皮肤和肠黏膜层受损斑马鱼的LD50分别为107和105CFU/ml,证实肠黏膜受损是斑马鱼感染迟钝爱德华氏菌的“诱导因素”之一,且感染程度与肠黏膜层受损程度有关。对健康及肠黏膜层受损斑马鱼感染EIB202后各组织炎症相关细胞因子进行考察,发现该菌可引起肠黏膜层受损斑马鱼强烈炎症反应,感染72h内多种组织中IL-1β、TNF-α和iNOS表达量显著上调。进一步研究证实,鱼体炎症反应中释放的抗菌物质(如阳离子抗菌肽)可破坏斑马鱼肠固有菌群组成,以利于EIB202在肠道处定植。透射电镜结果显示,未被免疫系统清除的EIB202可在肠道中长期定植。因此,养殖过程通过控制慢性肠炎将有助于迟钝爱德华氏菌病的防控。综上所述,斑马鱼皮肤和肠黏膜层受损分别是鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌感染鱼体的“诱导因素”之一。肠道是鳗弧菌减毒活疫苗MVAV6203进入斑马鱼体内并激发黏膜免疫应答的主要场所,疫苗可激发局部免疫与系统免疫且二者间存在免疫组分迁移现象。疫苗注射和浸泡接种方式激发免疫应答过程不同,但均可激发抗体和细胞介导的体液和细胞免疫。