背景:骨缺损的治疗是骨科难题,自体骨移植治疗效果最好,但存在取骨区并发症,某些人骨量不足甚至无法取骨的问题。为了解决这一问题,很多研究者从事骨移植替代物的研发,出现了大量新的生物活性材料,取得不错的动物实验效果,但是临床使用还需要进一步改进。传统的组织工程骨是将自体干细胞在体外培养扩增,再移植到支架材料,但是其存在制作过程复杂、运输难度大、污染风险大等难题,难以广泛运用。随着组织工程骨的高速发展,主要分为自募集型组织工程骨和干细胞富集型组织工程骨。我们课题组一直从事多种不同类型组织工程骨的研究,发现骨缺损的修复还是存在成骨不全和血管化不足的问题。因此,对于不同类型的骨缺损的修复,兼顾成骨和成血管十分重要。对于临界性骨缺损而言,自募集型组织工程骨具有一定的优势,其不需要额外种植细胞在支架上。当前很多研究报道,使用各种细胞因子或趋化因子修饰组织工程骨,能将骨髓间充质干细胞（MSCs）和内皮细胞募集到骨缺损处。尽管动物实验骨修复效果很好,但是这些细胞因子均超生理剂量,往往存在生物安全性问题。MSCs和内皮细胞在骨修复中起关键作用。在体内大部分骨髓MSCs分布在血管周围,内皮细胞对其生活的微环境具有重要调控作用。骨缺损修复的第一步就是要能够募集足够数量的MSCs和内皮细胞。这一过程包括启动从钙黏蛋白介导的细胞-细胞粘附到整合素依赖的细胞与外基质粘附和迁移。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是一种非受体酪氨酸磷酸酶,PTP1B酪氨酸152（Tyr152）磷酸化在稳定钙黏蛋白和β-连环蛋白粘附复合物中发挥重要作用,是调控整合素介导的细胞-基质粘附和细胞迁移的关键。前期课题组设计PTP1B Tyr152结构域模拟肽（152RM肽）,并验证了它可以有效抑制152位点酪氨酸磷酸化,能够强化整合素信号通路。然而,抑制PTP1B Tyr152磷酸化会不会引起整合素介导的MSCs和内皮细胞的迁移?将152RM肽负载在DBM支架上能不能有效募集细胞呢?目前尚未见相关报道。对于节段性骨缺损而言,很难在大段骨缺损中募集充足的细胞,干细胞富集型组织工程骨的优势更加明显。干细胞富集型组织工程骨是使用一定的技术方法使MSCs等细胞在支架上大量有效富集。之前课题组研究使用选择性细胞保留（SCR）技术能成功地增加了支架中MSCs的数量,促进了骨缺损修复。然而,由于我们忽略了提高支架的血管生成能力,其在体内修复节段性骨缺损的能力仍然有限。层黏连蛋白（LN）是基底膜和细胞外基质的主要成分。作为黏附配体的结合基序,通过整合素介导干细胞的分化。层黏连蛋白-α4（LN-α4）是血管基底膜的重要组成部分,不仅在维持内皮细胞增殖中起关键作用,而且还能维持成骨细胞增殖并诱导成骨分化。因此,我们尝试利用LN-α4的核心功能序列来修饰DBM支架,通过整合素介导的细胞粘附与分化,希望能实现增加SCR技术中MSCs和内皮祖细胞的粘附富集。方法:第一部分:首先,构建DBM-MSN/152RM支架,对材料的表征、亲水性、生物力学强度、生物安全性进行了评估。其次,利用Transwell体外实验观察支架材料对MSCs和内皮细胞迁移的影响。并在体外利用细胞划痕实验、RNA高通量测序（RNA-seq）、q RT-PCR、Western blotting等评估了152RM肽对MSCs和内皮细胞的迁移作用的可能分子机制。再次,建立股骨临界性骨缺损模型,并植入DBM-MSN/152RM支架,利用X线、Micro-CT、钙黄绿素-二甲酚橙双荧光标记、常规病理切片、免疫荧光染色、Von kossa染色和血管灌注造影等方法,观察了骨缺损愈合情况和血管生成情况。最后,利用成骨特异性染色评价了152RM肽影响MSCs成骨分化的作用,并分析可能的分子机制。同时,采用血管管腔形成实验和分子生物学方法,探讨了152RM肽对内皮细胞血管形成的作用和可能的分子机制。第二部分:首先,构建DBM/CBD-LN支架,对材料的表征、生物安全性进行了评估。其次,利用流式细胞技术、常规病理切片和免疫荧光染色,研究其在SCR技术中对细胞粘附和富集的作用和机制。再次,建立股骨节段性骨缺损模型,并在骨缺损处植入DBM/CBD-LN支架,利用Micro-CT、钙黄绿素-二甲酚橙双荧光标记、病理切片、免疫荧光染色和血管灌注造影等方法,观察了骨缺损愈合情况和血管生成情况。最后,利用成骨特异性染色检测了DBM/CBD-LN支架影响MSCs成骨分化的作用,并利用分子生物学方法分析了可能机制。同时,采用血管管腔形成实验检测了DBM/CBD-LN支架对内皮祖细胞血管形成作用的影响,并利用分子生物学方法研究了可能的机制。结果:（1）构建了DBM-MSN/152RM支架,其比表面积增大,能够增加152RM肽加载量,同时实现缓释的目的。DBM-MSN/152RM支架的亲水性能、生物力学强度没有下降,生物相容性较好,不影响细胞的活力、增殖和铺展能力,能够满足不负重情况下的骨再生的强度需求。（2）DBM-MSN/152RM支架在骨缺损修复中具有较强的募集MSCs和内皮细胞能力。152RM肽能够增强MSCs的迁移能力,可能是通过CXCR4和整合素αvβ3介导,激活了其下游的FAK/STAT3信号通路。152RM肽也能增强内皮细胞的迁移能力,可能是通过增强整合素αvβ3和VEGFR2信号通路之间的串扰,诱导FAK-ERK1/2依赖的内皮细胞迁移。（3）DBM-MSN/152RM支架在骨缺损处不仅具有较强的新骨矿化和塑形能力,还促进H型血管快速生长,实现了骨生成和血管生成的有机偶联。（4）152RM肽能促进MSCs成骨分化,可能部分通过下调内质网应激,促进β-catenin入核,从而激活经典Wnt信号通路。152RM肽还能增强内皮细胞管腔形成,可能与激活内皮细胞Notch信号通路有关。（5）构建了DBM/CBD-LN支架材料,CBD-LN能够通过胶原结构域稳定地结合到DBM表面,形成稳定的支架。DBM/CBD-LN支架比表面积增大,能够增加细胞的粘附和铺展空间。DBM/CBD-LN支架的生物相容性较好,对细胞的活力和铺展能力无抑制作用。（6）DBM/CBD-LN支架对MSCs和内皮祖细胞具有较高的粘附能力。整合素α5β1可能是增强MSCs在DBM/CBD-LN支架粘附的主要分子。整合素αvβ3可能是增强内皮祖细胞在DBM/CBD-LN支架粘附的主要分子。（7）DBM/CBD-LN支架不仅具有较强的新骨形成能力,而且能够促进骨缺损处血管生成,关键是H型血管快速生长。（8）DBM/CBD-LN支架能促进MSCs的成骨分化,可能的机制是通过诱导FAK-ERK1/2信号通路的激活。DBM/CBD-LN支架可能激活内皮祖细胞中的HIF-1α/VEGF通路,从而加快血管生成过程。结论:通过本课题的研究,基于整合素介导的细胞募集迁移与粘附分子事件,开发的不同类型组织工程骨。对于临界性骨缺损,构建的新型DBM-MSN/152RM支架,体内有效募集MSCs和内皮细胞,偶联骨生成和血管生成。提示了抑制PTP1B Tyr152磷酸化水平,能够增强整合素介导的MSCs和内皮细胞的运动性能,并促进成骨分化和血管管腔形成,为临界性骨缺损修复提供了新思路。对于节段性骨缺损,构建了DBM/CBD-LN支架,能够增强SCR技术中整合素介导的MSCs和内皮祖细胞的粘附富集能力,偶联骨生成和血管生成,为节段性骨缺损修复提供了新的视角。