[研究背景]膀胱癌是全世界常见的高发病和致死率的肿瘤之一,对人类生命健康财产有着巨大威胁,膀胱癌的发病率在我国部分地区居泌尿系统第一。手术是膀胱癌治疗的金标准,但对无手术条件的患者,药物治疗表现出了巨大的益处。随着研究的推进,抗肿瘤药物种类从单一的以丝裂霉素为代表的细胞毒性化疗药物,逐步衍生出以戈舍瑞林为代表的激素类、和增强免疫功能达到抗肿瘤效果的卡介苗等生物反应调节剂,以及靶向等药物。不能手术患者,尤其膀胱癌晚期患者的生存明显得益于药物治疗,但严重的药物毒副作用和耐药性,以及昂贵的费用同样限制了治疗。近年来,中草药提取物因为其安全、有效、易获得等优点被应用于肿瘤的治疗。本课题为了增加膀胱癌化疗药物选择的丰度,通过前期文献调研,发现从茄碱类果实中分离得到的澳洲茄胺以及樟科植物乌药的干燥块茎提取的乌药内酯具有抗氧化、抗肿瘤和抗感染等多种功能,但其在肿瘤中的研究较少,并且未见其在膀胱癌中的研究报道。[目 的]本研究旨在通过体内外的研究,明确澳洲茄胺与乌药内酯对膀胱癌生物恶性行为的影响,并且阐明参与调控的分子机制,为深入综合研究膀胱癌的药物治疗靶点和作用机制奠定理论基础,同时为膀胱癌的临床诊治提供支撑的理论依据。[方 法]1.澳洲茄胺和乌药内酯在体外对人膀胱癌细胞生物恶性行为的影响（1）在体外,用不同浓度的澳洲茄胺处理膀胱癌细胞株BIU-87和EJ或用乌药内酯处理膀胱癌T24和EJ细胞株24 h和48 h,CCK-8法检测细胞活力的改变,并且计算澳洲茄胺和乌药内酯作用于膀胱癌细胞株24 h或48 h的半数抑制浓度（Inhibitory Concentration 50,IC50）值。同时利用CCK-8法检测澳洲茄胺和乌药内酯对正常尿路上皮SV-HUC-1细胞的毒力。（2）澳洲茄胺和乌药内酯处理膀胱癌细胞,分别在0h、12 h、24 h以及36 h镜下拍照,并通过划痕愈合面积计算澳洲茄胺和乌药内酯对膀胱癌细胞迁徙能力的影响。（3）澳洲茄胺和乌药内酯处理膀胱癌细胞株48h,处理后的膀胱癌细胞用70%乙醇固定24 h,后对细胞进行PI染色,然后通过流式细胞仪分析澳洲茄胺和乌药内酯对膀胱癌细胞株周期的影响。（4）澳洲茄胺选择48 h的IC50值处理膀胱癌细胞株24 h和48 h,乌药内酯选择高于和低于48 h的IC50值处理膀胱癌细胞株48 h,收集细胞后进行AnnexinV-FITC/PI染色,随后通过流式细胞仪分析澳洲茄胺和乌药内酯促进膀胱癌细胞凋亡的效果。2.澳洲茄胺和乌药内酯通过线粒体介导的途径促进膀胱癌凋亡（1）澳洲茄胺和乌药内酯处理膀胱癌细胞株48 h,利用Q-PCR方法检测线粒体抗凋亡蛋白BCL-2和促凋亡蛋白BAX、BAK1以及细胞色素C（Cytochrome C,CYCS）的mRNA表达水平与对照组的差异。（2）澳洲茄胺和乌药内酯处理膀胱癌细胞株48 h,采用western blot方法检测BCL-2、BAX、BAK1和CYCS等凋亡蛋白的表达水平与对照组的差异。3.澳洲茄胺和乌药内酯在体内抑制膀胱癌生长的效果（1）选用膀胱癌BIU-87、T24和EJ细胞株,构建小鼠皮下膀胱癌移植瘤模型,以体外实验结果为依据,在肿瘤体积达到50-100 mm3时,小鼠腹腔注射一定浓度的澳洲茄胺或乌药内酯,每3天1次,当对照组肿瘤体积平均达到1000 mm3时终止实验,并且称量肿瘤重量,同步绘制生长曲线和重量散点图。（2）收集小鼠膀胱癌皮下荷瘤的标本,通过HE染色观察澳洲茄胺和乌药内酯对膀胱癌的病理改变。对线粒体相关凋亡蛋白BCL-2、BAK1、BAX以及CYCS 进行免疫组化染色（immunohistochemistry,IHC）。[结 果]澳洲茄胺呈时间和浓度依赖性抑制膀胱癌BIU-87和EJ细胞株的生物活性,24h的IC50值在SV-HUC-1、BIU-87和EJ细胞株分别为108.7±1.681μM/L、48.38±2.096 μM/L 和 29.76±0.704μM/L,48 h 的 IC50 值分别为 86.1±1.499μM/L、41.82±2.034μM/L 和 26.29±1.694 μM/L。选择药物浓度为 35μM/L和 20μM/L,作用时长为24 h和48 h的给药方式用于后续澳洲茄胺对膀胱癌作用以及机制的实验。乌药内酯亦依赖时间和浓度抑制膀胱癌T24和EJ细胞株的生物活性,24 h 的 IC50 值在 SV-HUC-1、T24 和 EJ 细胞株分别为 912.9±1.32μM/L、542.4±2.176μM/L和 568.7±2.32μM/L,48 h的IC50值分别为931.8±1.603μM/L、301.7±2.734 μM/L 和 325.8±2.598 μM/L。选择药物浓度为 250 μM/L 和 350 μM/L,作用时长为48 h的给药方式用于后续乌药内酯对膀胱癌作用以及机制的实验。同时,澳洲茄胺和乌药内酯对正常膀胱上皮细胞的半数抑制浓度值均远高于膀胱癌细胞,可见两种药物对正常尿路上皮细胞的毒性作用弱。澳洲茄胺和乌药内酯均明显降低了膀胱癌细胞的迁移能力,同时将膀胱癌细胞BIU-87、EJ和T24的细胞周期均阻滞在G0G1期。进一步分子机制发现,澳洲茄胺可通过降低线粒体抗凋亡分子BCL-2,升高促凋亡分子BAK1、BAX以及CYCS的基因和蛋白表达量,从而诱导膀胱癌的凋亡。同样,乌药内酯也可通过升高促凋亡分子BAK1、BAX以及CYCS的基因和蛋白表达量,从而诱导膀胱癌的凋亡。在小鼠体内实验中,BIU-87细胞株未能成瘤,澳洲茄胺和乌药内酯均有明显抗肿瘤生长的效果,澳洲茄胺对膀胱癌EJ细胞移植瘤的抑制率为69.56%。乌药内酯对膀胱癌T24和EJ细胞移植瘤的抑制率分别为75.24%和71.58%。HE染色可见治疗组肿瘤部分溶解,免疫组织化学染色显示澳洲茄胺降低抗凋亡蛋白BCL-2的表达,澳洲茄胺和乌药内酯可提高促凋亡蛋白BAK1、BAX的表达。[结 论]本研究首次发现茄科植物提取物澳洲茄胺和樟科植物的提取物乌药内酯在体外均具有抗膀胱癌的功能,并且具有较宽的用药浓度安全范围,还均可通过阻滞细胞周期在G0/G1期发挥抗肿瘤作用。进一步分子机制研究发现,澳洲茄胺和乌药内酯可通过调控促凋亡蛋白BAK1、BAX和CYCS蛋白以及抗凋亡蛋白BCL-2的表达量达到促凋亡的效果。而在体内实验中,澳洲茄胺和乌药内酯同样表现了优秀的抗肿瘤生长的作用。