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近年来男性不育症的发病率逐年升高,全球各地区的生育率也呈现逐年下降趋势,如何有效预防和治疗男性生殖功能障碍已成为人们共同面临的亟待解决的严峻问题。牡蛎肉营养价值高,富含蛋白质、糖原、氨基酸、微量元素等营养成分。大量研究表明牡蛎肉提取物具有抗氧化、增强机体免疫、抗疲劳、抗皮肤光老化、降血压、降血糖和醒酒护肝等多种生物活性,但目前关于牡蛎肉提取物对男性生殖损伤保护作用的研究报道较为少见,且相关作用机制不甚明晰。因此,本研究以牡蛎肉为原料,经酶法水解得到牡蛎酶解产物,对其进行分离纯化并同步评价分离组分的体外抗生殖损伤活性,同时对活性组分进行小鼠体内生殖功能损伤保护作用活性评价和相关作用机制的初步探究。然后将分离纯化得到的组分进行质谱鉴定,分析其结构表征及潜在活性。最后将可信度较高的小分子肽进行人工合成,通过体外细胞实验验证合成肽的抗生殖功能损伤活性并进一步探究其可能的作用机制,主要研究内容和结果如下:(1)采用动物蛋白酶制备牡蛎酶解产物,通过超滤分级,分离得到UF1(>10ku)、UF2(5~10 ku)、UF3(3~5 ku)和UF4(<3 ku)四个牡蛎酶解超滤组分(UF),测定其基本理化成分,并通过TP诱导的TM4小鼠睾丸支持细胞损伤模型,测定细胞存活率、细胞内还原性谷胱甘肽(GSH)和丙二醇(MDA)含量、细胞内活性氧(ROS)水平等评价UF对TM4细胞的保护作用。结果表明,UF富含铜(Cu)、锌(Zn)、锰(Mn)和硒(Se)等微量金属元素;经超滤分级,不同分子量段的牡蛎酶解产物得到了有效分离;UF2、UF3和UF4的粗蛋白含量分别为67.12%、65.06%和64.25%,氨基酸总量分别为58.21%、54.11%和54.75%,均远高于UF1的39.04%和27.47%;通过细胞毒性实验成功建立TP损伤TM4细胞模型,TP对TM4细胞的毒性作用和氧化损伤具有剂量依赖性,TP在500nmol·L-1浓度下作用于TM4细胞24 h,细胞存活率仅为64.29%;UF2、UF3和UF4均可显著改善TP诱导的TM4细胞毒性损伤,效果均优于UF1;UF4可有效抵抗TP对TM4细胞的氧化损伤,提高细胞存活率和细胞内GSH含量,减少细胞内ROS的产生和MDA含量,且活性优于UF2和UF3。(2)通过对小鼠腹腔注射TP成功建立雄性小鼠生殖损伤模型,采用精子参数分析、睾丸苏木素-伊红(HE)染色及睾丸组织学评价、睾丸组织酶活测定、血清生殖激素水平测定、DNA缺口末端标记法(TUNEL)染色检测和蛋白免疫印迹(Western Blot)技术等方法,研究UF4对TP诱导的雄性小鼠生殖损伤的保护作用评价及其可能相关作用机制。研究结果表明,UF4显著改善了TP诱导的小鼠精子质量恶化,提高了精子数量和活力,降低了精子畸形率。UF4缓解了小鼠睾丸组织的萎缩和形态学异常,睾丸组织空泡化明显减少。UF4降低了TP诱导的小鼠睾丸组织内MDA含量,提高了超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力,减轻了睾丸组织氧化应激。此外,UF4还提高了小鼠睾丸能量代谢相关酶(LDH、ALP和ACP)的活性,同时使小鼠血清激素水平恢复正常。UF4显著改善了TP诱导的睾丸曲细精管细胞总数的减少,抑制了凋亡细胞数量和比例的增加。UF4通过促进睾丸组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白的表达,进而增加了抗氧化酶调节蛋白血红素氧合酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO1)的表达,抑制了c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化和Bcl-2/Bax介导的细胞凋亡。(3)采用Sephadex-G25葡聚糖凝胶层析对UF4超滤组分分离得到7个组分(F1-F7),其中分离组分F1、F4、F6和F7均能显著提高经TP损伤后TM4细胞的细胞存活率,显著减少细胞内MDA含量,提高细胞内GSH含量,比较而言F6抑制TP对TM4细胞氧化损伤的活性优于F1、F4和F7。通过C18反向高效液相色谱对F6组分进一步分离,收集得到4个纯化组分,其中F6-3保护TP诱导的TM4细胞毒性损伤的活性最佳。对F6-3进行UPLC-MS/MS质谱鉴定得到SSSDMFR、SDPLYP、YGGA、THPS、VISNVC和YQGMYNW六个小分子肽。将这6个小分子肽与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)进行分子对接,结果表明6个小分子肽与Keap1靶点蛋白存在很好的结合作用且匹配度高,结合能均远小于-5 kcal/mol,它们均能够与Keap1蛋白的活性口袋形成多个氢键相互作用,并形成稳定的复合物。(4)采用固相合成的方法对鉴定得到的六个小分子肽(P1-P6)进行人工合成,通过细胞实验活性评价,发现不同浓度(0.1-0.4 mM)的P1-P6合成肽均不同程度地抑制了TP对TM4细胞的毒性损伤和氧化损伤。其中,P2(SDPLYP)和P4(THPS)可同时显著提高TM4细胞内GSH含量,减少细胞内MDA含量,并显著抑制TP诱导的TM4细胞内ROS的生成和细胞凋亡率的增加,激活Nrf2/Keap1信号通路并显著上调Nrf2、Keap1、HO1和NQO1蛋白的表达,进一步提高细胞内抗氧化防御能力。同时,P2(SDPLYP)和P4(THPS)合成肽显著降低JNK磷酸化,减少ROS对细胞线粒体功能的影响,进一步通过影响Bax/Bcl2信号通路,促进抑凋亡蛋白Bcl2的表达,抑制促凋亡蛋白Bax的表达,减少TP诱导的TM4细胞凋亡。