流感是由流感病毒（Influenzavirus）引起的急性呼吸道感染病,每年季节性流感流行都给全球造成严重的疾病负担。流感病毒的基因组特征和宿主多样性,导致自然界的流感病毒型别众多且高度变异,给流感疫情防控和流感患者诊治带来许多挑战,尤其是流感病毒感染导致的重症肺炎和多病原体共感染现象不容忽视。因此,建立一套可高效、精准检测流感病毒的方法对流感患者临床救治和流感疫情防控均具有重要意义。近年来,随着高通量测序技术的发展和测序成本的不断降低,使基于高通量测序技术实现对多种已知病原体及未知病原体的精准测序鉴定成为可能,本研究以流感病毒为检测对象,建立适用的二代测序和三代测序技术,以期构建高效可行的流感精准诊断体系。然而高通量测序技术对于流感病毒等RNA类病原体的鉴定及测序分析一直存在诸多挑战:（1）样本RNA丰度低且不稳定使测序文库构建失败导致无法上机测序;（2）背景RNA干扰大,影响测序准确率;（3）软件选择、参数设置和参比数据库的不完善造成测序准确性即一致性（identity）较低等问题,不能满足流感病毒精准诊断的需求。为解决上述问题,本研究从RNA病毒的样本提取、反转录、扩增、文库构建和数据分析等方面优化整个检测体系:（1）显著提升RNA提取效率,使流感病毒的测序灵敏度提高100倍,使样本检测下限从1.09×106降低到1.09×104 TCID50/mL;（2）测序产物中读取到的宿主rRNA序列片段占比（reads distribution）显著下降,病毒RNA序列片段占比显著提升,如优化前的宿主rRNA占比约69%、病毒RNA占比约5%,经过反转录等优化处理后病毒RNA占比可提升至约26.1%,进一步经富集扩增后病毒RNA占比可高达99%;（3）测序准确性显著提升,测序数据的测序覆盖率从27.98上升到100%,测序深度从不到几十提升到数十万。在此基础上,本研究用12份流感病毒样本进行平行比较分析,形成一套适合临床诊断的最佳流感样本精准检测体系,即先用荧光定量PCR进行流感鉴别,若为流感阳性,则进一步进行三代测序分析,确定具体的流感型别和共感染病原体种类,然后结合患者的临床症状与预后情况,考虑进一步的二代测序分析,对感染病原体进行全基因组测序。该流程可满足临床流感患者的高效和精准诊断需要,3 h内可确定样本中流感病毒型别,12 h内可确定样本中流感病毒的具体毒株名称及共感染病原体种类,24 h内可确定样本中流感病毒全基因序列。综上,本研究优化了不同类型流感病毒样本的核酸提取及反转录方法,建立了流感病毒扩增子测序方法,完善了高通量测序平台数据处理分析流程,成功构建了基于高通量测序技术的流感病毒精准诊断方法,为流感临床救治和新发流感疫情的防控提供重要的技术支持。