2019年底以来,新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）疫情席卷全球,感染性废物的数量急剧增加,对人们的健康和疫情防控构成严重威胁。对感染性废物进行安全、及时、专业的处置,是确保不发生二次传播、阻断疫情扩散的重要环节。COVID-19疫情给感染性废物的处理带来了许多挑战,比如数量剧增、运输中出现破损泄漏、风险区域及人员管控等。因此,需要加强对感染性废物快速原位消毒技术的研究。微波消毒作为一种物理消毒方法,是热效应和非热效应的综合作用,与其它消毒方法相比,微波消毒具有快速、穿透能力强、升温均匀、节能高效、便捷、经济环保等特点,尤其适用于感染性废物的原位无害化处理。目前,微波消毒效果的定量评价主要集中在细菌方面,病毒较少,且其灭活机制尚未明确。病毒性呼吸道传染病具有病毒基因容易变异、传播途径容易实现、传播迅速广泛、人群普遍易感等特点,极易造成暴发和流行。因此,在COVID-19全球大流行的当下,研究微波对感染性废物中呼吸道病毒的灭活作用,建立快速原位无害化处理微波消毒技术尤为重要。考虑到生物安全等级的限制,本研究选择麻疹病毒（measlesvirus,MV）作为呼吸道RNA病毒的代表,以疫情期间常用的口罩、手套、棉签作为载体,模拟感染性废物,研究微波的灭活作用及其影响因素,探讨微波消毒的分子机制,为开发感染性废物中呼吸道病毒的快速原位无害化处理微波消毒技术提供科学依据,对于防控病毒性呼吸道传染病具有重要的现实意义。目的研究微波快速消毒的过程中携带呼吸道RNA病毒的感染性废物上病毒灭活的特点、规律及其分子机制,为开发感染性废物的快速原位无害化微波消毒技术提供科学依据。方法1.病毒悬液的制备及滴度测定MV接种于Vero-SLAM细胞,在35℃、5%CO2的条件下培养至细胞病变程度达到75%以上,反复冻融3次后离心收获病毒悬液,经50%终点法测定病毒的半数细胞培养感染量（50%cell culture infectious dose,CCID50）。2.模拟感染性废物的制备将25 μL MV液滴染在无菌的3 cm×3 cm 口罩样片、手套样片和棉签三种载体上,模拟被MV污染的感染性废物。3.微波条件的设置及处理将三种载体模拟的感染性废物分别放在特制微波装置内的固定位置,在300W、500 W、700 W的输出功率（简称“功率”）下分别处理30 sec、60 sec、90 sec,并在功率为300W时,以口罩载体为普通组,另设感染性废物的增湿组和包裹组。感染性废物的增湿组指25 μL病毒液与75 μL细胞维持液混匀后滴染在口罩样片上,感染性废物的包裹组指在滴加25 μL病毒液的口罩样片外层包裹一个完整口罩。记录各组在微波处理过程中的温度变化,同时设置未经微波处理的病毒对照组。模拟感染性废物经微波处理后,将载体放入5 mL预冷的细胞维持液中,旋涡混合30 sec,在4℃条件下3000×g离心10 min,收集上清液。采取相同步骤收集病毒对照组载体上的病毒。4.微波灭活MV的效果评价（1）杀灭率 将微波处理后收集到的上清液经10倍系列稀释,接种至Vero-SLAM细胞,采用50%终点法测定病毒CCID50,计算杀灭率,杀灭率（%）=[1-（实验组CCID50/病毒对照组CCID50）]×100%;（2）合胞体减少率 MV感染Vero-SLAM细胞的典型细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）是细胞融合形成合胞体。将微波处理后收集到的上清液接种至Vero-SLAM细胞,培养36 h后经Giemsa染色计数合胞体数目,计算合胞体减少率,合胞体减少率（%）=[1-（实验组合胞体数/病毒对照组合胞体数）]×100%;（3）病毒增殖能力 将微波处理后收集到的上清液接种至Vero-SLAM细胞,培养48 h后提取病毒RNA,经实时荧光定量反转录聚合酶链反应（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测病毒增殖情况,以定量评价微波对MV的灭活效果。5.微波对MV基因的影响从微波处理后收集到的上清液中提取病毒RNA,通过反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）分别扩增 MV 的 N、P、M、F、H、L 基因,检测微波对病毒基因的损伤情况。6.热处理对MV活性的影响选择微波处理过程中的最高温度分别对MV处理30 sec、60 sec、90 sec,检测病毒活性,并通过RT-PCR扩增MV的基因,与微波处理的结果进行比较,进一步探讨微波灭活MV的机制。7.数据分析采用SPSS 26.0对数据进行统计学分析,实验重复3次,采用t检验和单因素方差分析比较各组之间的lgCCID50、Ct值,对杀灭率和合胞体减少率进行Pearson相关分析并绘制Bland-Altman图进行一致性评价,α=0.05。结果1.MV悬液的滴度经50%终点法测定,收获的MV悬液中,MV的滴度为105.7 CCID50/0.1mL。2.微波引起的温度变化微波会引起温度升高,增加微波功率、处理时间或感染性废物的湿度,微波引起的升温随之增加,在700 W、90 sec的微波条件下达到最高温度80℃。微波功率高或处理时间长的实验组在温度升至最高后会出现温度回落,且载体的类型不同,温度变化也不一样。3.微波对MV的杀灭情况及影响因素杀灭率检测结果表明,载体不同,杀灭效果也不相同;增加微波功率或处理时间,杀灭率随之增加,说明微波对MV的杀灭作用增强。口罩作载体,微波条件为500 W、90 sec或700 W、30 sec时,杀灭率已超过99.61%;手套作载体,微波条件为500 W、30 sec时,杀灭率已超过99.50%;棉签作载体,微波条件为500 W、90 sec或700 W、30 sec时,杀灭率已超过97.65%。相同微波处理时间内,增湿组和包裹组的杀灭率比普通组高,说明增加感染性废物的湿度或进行包裹处理可以增强微波对MV的杀灭作用。4.微波对合胞体减少率的影响及影响因素合胞体计数结果表明,不同载体上的MV合胞体减少率不尽相同,但微波功率或处理时间增加时,合胞体减少率均随之增加,在700 W、90 sec的微波条件下三种模拟感染性废物载体上MV的合胞体减少率均达到100%,通过增加感染性废物的湿度或进行包裹处理可以提高合胞体减少率。5.杀灭率与合胞体减少率的一致性评价对同一微波条件下的杀灭率与合胞体减少率进行一致性评价,Pearson相关分析结果显示二者呈高度相关（r＞0.9,P＜0.001）,Bland-Altman图显示二者呈良好的一致性（H0:Mean=0,P＞0.05）。6.微波对MV增殖能力的影响及其影响因素qRT-PCR结果显示,与病毒对照组相比,微波功率越高或处理时间越长的实验组,Ct值越大,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与病毒对照组相比,普通组Ct值在60 sec的差异具有统计学意义（P＜0.05）,而增湿组、包裹组的Ct值在30 sec的差异便具有统计学意义（P＜0.05）,所需时间更短。说明增加微波功率、处理时间、感染性废物的湿度和进行包裹处理均可以增强微波抑制MV增殖的能力。7.微波对MV基因的损伤情况RT-PCR结果显示,微波对MV的N、P、M、F、H、L基因均具有损伤作用,且功率越高或时间越长,损伤越严重。8.热处理MV的灭活情况选择微波处理过程中的最高温度80℃作为MV热处理的温度,单独对MV进行热处理。结果显示,80℃热处理的MV杀灭率低于同等处理时间、功率为500 W或700 W时微波处理的杀灭率,且80℃加热90 sec不会损伤MV的基因。结论1.携带25μL病毒滴度为105.7 CCID50/0.1mL MV的口罩、手套、棉签三种模拟感染性废物,微波功率700 W处理90 sec,可以灭活99.99%以上的病毒。灭活效果受载体类型的影响,与微波功率、处理时间呈正相关,增加感染性废物的湿度以及进行包裹处理能增强微波对MV的灭活作用。2.微波对MV的灭活效果高于热处理,其机制与微波的非热效应损伤MV的基因有关,且受损程度与微波功率、处理时间呈正相关。