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一、研究背景及目的气候变暖、海水富营养化等原因导致的全球海域水母暴发性增长被称为海洋第二大生态灾难,近些年来对人类生产生活造成了严重影响。隶属于钵水母纲(Scyphozoa)的海月水母(Aurelia sp.)是全世界最常见、也是造成海洋生态灾难的主要物种之一。海月水母具有世代交替的繁殖特性,水螅体为其主要的生活形式,而水母体每年仅存在2~4个月,正是由于水螅体在海月水母生活史中的重要地位,使得海月水母能够在数亿年来变化无常的环境中生存繁衍下来。所以有学者认为,水母暴发是一种迁徙行为,是对环境变化的应激反应,是水母能够持续生存、繁衍的重要策略,而从营固着生活的水螅体变态发育为营浮游生活的水母体则是这种生物迁徙行为中极为重要的一环,也是水母暴发的重要基础。既往针对水母蛰伤防控的研究主要关注于成熟水母体的毒性及蛰伤防治机制的探索,对其变态发育过程及机制研究较少。事实上,变态发育是水母生命过程中的关键事件,而横裂作为水母变态发育的起点,直接决定了其最终产生蝶状体的数量,因此,抑制早期横裂发生进而减少蝶状体释放数量是控制水母数量、减少水母暴发的重要策略。基于该事实,本研究构建了模拟现实环境的物理诱导Aurelia coerulea变态发育体系和稳定高效的化学诱导A.coerulea变态发育体系并进行多项相关研究。在比较水螅体与水母体生物毒性时我们发现,相比于水母体,A.coerulea水螅体具有更为强烈的致死毒性与溶血毒性。与此同时,多项研究也已表明,同样也是水母毒素主要活性成分的金属蛋白酶和磷脂酶等毒素分子,在家蚕、蟑螂等其他物种变态发育涉及的组织重构中也发挥了重要作用。由此我们提出,随着变态发育过程变化的生物毒素可能在水母的变态发育过程中也发挥了重要作用。基于上述背景,本研究拟通过对A.coerulea变态发育不同阶段的毒性及主要毒素活性进行评价来探究其在A.coerulea变态发育过程中的动态变化情况,通过主要毒素分子抑制剂对变态发育过程的干预效应来对在变态发育过程中发挥重要作用的毒素种类进行筛选,随后以基因组和多阶段转录组学数据库为数据基础、以生物信息学技术为引导手段,期望归纳提出在A.coerulea变态发育中发挥重要效应的信号调控网络。二、研究内容1.A.coerulea基因组构建,A.coerulea及近缘物种的比较基因组学分析。2.A.coerulea水螅体变态发育的物理和化学诱导模型的建立与评价,基于多阶段有参转录组的A.coerulea变态发育过程中主要毒素分子表达量动态变化的分析,A.coerulea变态发育过程中毒性动态变化及主要毒素活性动态变化的评价。3.主要毒素抑制剂对A.coerulea变态发育过程干预效应的评价,基于多阶段转录组的关键毒素分子及信号通路的筛选。三、研究方法(一)A.coerulea基因组构建及比较基因组学分析1.A.coerulea基因组学构建本研究通过Pacbio Sequel平台进行测序,测序深度为120×。综合利用三代测序、二代测序、10×Genomic和Hi-C对A.coerulea基因组进行组装。基因组注释主要包括重复序列注释、基因结构预测、基因功能预测和非编码RNA注释。2.A.coerulea及近缘物种的比较基因组学分析本研究的基因家族鉴定选用Ortho MCL流程,利用单拷贝基因家族序列对各家族进行MUSCLE比对,基于序列比对结果利用RAx ML软件采用极大似然法对近缘物种进行系统发育树的构建。使用PAML软件包中的mcmctree进行分歧时间估计,使用Tracer验证其收敛性。使用CAFE软件进行基因家族扩增和收缩分析。结合NR和Pfam注释确定基因家族基因,进行毒素相关基因家族的鉴定分析。(二)A.coerulea变态发育过程中毒素的动态变化1.A.coerulea变态发育物理和化学诱导体系的建立在A.coerulea水螅体实验室微观养殖体系的基础上,分别采用降温至10℃和添加化学诱导剂5-甲氧基-2-甲基吲哚的方式构建A.coerulea水螅体变态发育物理和化学诱导体系。2.基于多阶段转录组学分析变态发育过程中主要毒素分子表达量的动态变化利用本地Blast工具将基因序列与Uniprot的毒素数据库进行序列比对,利用E-value<0.00001过滤不合格序列,用最大比对长度和相似度筛选出A.coerulea基因组中的毒素基因。基于NCBI公共数据库获取A.coerulea变态发育不同阶段的转录组测序原始数据,采用快速比对工具HISAT2及量化和确定表达值的工具String Tie获取A.coerulea基因组基因在不同时期的表达量,通过K-Means/K-Medians Clustering对毒素表达情况进行聚类分析。3.A.coerulea变态发育不同阶段蛋白提取物毒性及酶活性评价对A.coerulea变态发育不同阶段样本的蛋白提取物的整体动物毒性、溶血活性、金属蛋白酶活性和磷脂酶活性进行评价。(三)影响A.coerulea变态发育关键毒素分子的筛选及其作用机制研究1.关键毒素抑制剂对变态发育的干预效应、关键毒素分子基因敲低及关键毒素分子的筛选选择蛋白酶或金属蛋白酶抑制剂EDTA、Batimastat、Ilomastat、MMP-9-IN-1、ARP-100、S 3304和T-26C,磷脂酶抑制剂或Ca2+拮抗剂QD、DP和EGTA作为潜在抑制剂,将其加入A.coerulea变态发育诱导体系中观察其对A.coerulea变态发育的影响。对高表达的金属蛋白酶进行基因敲低来对关键毒素分子进行筛选。2.关键毒素分子上游信号通路的生信分析与预测采用PROMO对可能结合在关键分子序列5’-UTR上游启动子序列的转录因子进行预测,对富集到的前10条KEGG通路进行变态发育多阶段表达量变化的分析,通过K-Means/K-Medians Clustering对主要信号通路相关分子的表达情况进行聚类分析。四、研究结果(一)A.coerulea基因组构建及比较基因组学分析1.A.coerulea的基因组学构建及分析本研究中A.coerulea基因组的总测序量为66.69 G,组装后Contig总长534.63Mbp,N50达到1.54 Mbp。组装到染色体水平的序列共有21条,基因组挂载率达99.65%,非冗余重复序列总长为347,322,052 bp,占全基因组序列总长的64.66%。本研究中的A.coerulea基因组共预测出基因21,999个,采用NR,Swiss Prot,KEGG,Inter Pro,GO以及Pfam等数据库进行比对,最终注释基因总数为21,659个,各数据库分别为17,511,12,593,12,092,21,549,19,478和12,503个。2.A.coerulea比较基因组学分析相对于A.aurita(jellyfish Aurelia)、A.aurita(Baltic sea)和Morbakka virulenta3个近缘物种,A.coerulea特有的基因家族共计665个;相对于A.aurita(Baltic sea)、M.virulenta、A.aurita(jellyfish Aurelia)、Nemopilema nomurai、Clytia hemisphaerica、Hydra vulgaris、Acropora digitifera、Orbicella faveolata、Stylophora pistillata、Nematostella vectensis、Exaiptasia pallida、Homo sapiens和Drosophila melanogaster 13个物种,A.coerulea特有的基因家族为450个。基因家族扩张收缩分析的结果表明,A.coerulea扩张了223个基因家族,收缩了101个基因家族。从物种分歧时间结果看到,A.coerulea与A.aurita(jellyfish Aurelia)所在进化枝的分歧时间约在66.8百万年前。在ADAM、ADAMTS、MMP及Zinc_metalloprotease这4个金属蛋白酶相关家族的拷贝数上,A.coerulea并没有显著的扩张或收缩趋势,而A.digitifera相比于A.coerulea、N.vectensis和H.vulgaris在MMP和Zinc metalloprotease上有收缩趋势。(二)A.coerulea变态发育过程中主要毒素分子的动态变化1.成功构建A.coerulea水螅体变态发育物理及化学诱导体系在物理诱导体系下,A.coerulea水螅体在诱导后的第50天开始出现横裂现象,与之相比,化学诱导体系中水螅体24小时内即可开始横裂,8~9天即可发育为蝶状体,诱导效率更高且相对稳定。2.A.coerulea主要毒素分子的不同亚型在其变态发育过程中的表达量不同筛选到的20余类795种毒素分子的表达量从整体水平上来看基本稳定,但就单个毒素分子而言,每一种毒素分子的表达都有其不同的变化特征,而具有近似表达变化特征的毒素又不属于同一类。除此之外,部分金属蛋白酶家族分子还存在早期横裂体阶段特异性高表达的现象,而对于磷脂酶而言,部分分子主要表现为在水螅体和早期横裂体阶段表达量较高,而在随后的晚期横列体、蝶状体阶段表达量则下降。3.A.coerulea变态发育过程中不同阶段样本蛋白提取物毒性和酶活性不同A.coerulea水母体的蛋白提取物既无明显的整体动物毒性,又无明显的溶血活性;而A.coerulea水螅体的蛋白提取物对整体动物既有急性毒性,又具有明显的溶血活性。在变态发育早期横裂阶段,金属蛋白酶活性明显升高;而磷脂酶活性在蝶状体阶段最低,在其他阶段较为一致。(三)影响A.coerulea变态发育关键毒素分子的筛选及其作用机制研究1.金属蛋白酶抑制剂对A.coerulea变态发育进程有明显的干预效应,而磷脂酶抑制剂的干预效应较弱广谱蛋白酶抑制剂EDTA、广谱金属蛋白酶抑制剂Ilomastst和Batimastat,MMP-2/9共同抑制剂S 3304,MMP-2抑制剂ARP-100、MMP-9抑制剂MMP-9-IN-1以及MMP-13抑制剂T26C等金属蛋白酶抑制剂均能明显延缓A.coerulea水螅体变态发育早期横裂的发生。此外,广谱蛋白酶抑制剂(EDTA)、广谱金属蛋白酶抑制剂(Ilomastst和Batimastat)和MMP-2/9抑制剂(S 3304)还能够明显影响A.coerulea水螅体变态发育的早期横裂率。并且在所有金属蛋白酶抑制剂的作用下,水螅体经变态发育所生成的蝶状体数量也明显减少。使用磷脂酶抑制剂DP、QD以及Ca2+螯合剂EGTA干预时,发现仅能在变态发育诱导的前24小时影响A.coerulea水螅体的横裂率,而对变态发育的其他阶段以及蝶状体的生成数量都无明显的影响。2.MAPK和PI3K-Akt两条信号通路可能通过调节金属蛋白酶表达而最终影响变态发育早期横裂的发生金属蛋白酶CTG_112.19不仅在横裂阶段表达量增加最显著,其RNAi敲低的效率也超过80%。根据CTG_112.19的上游启动子序列,筛选出ZIC2、YY1等10种潜在转录因子。对富集的信号通路进行分析发现,MAPK信号通路相关的关键分子Sos、Ras、Raf、MEK以及ERK,以及核内与金属蛋白酶相关的转录因子c-Jun、c-Fos和c-Myc的表达量在横裂早期均呈现出明显的升高趋势,发挥MAPK经典通路负性调节作用的PI3K-Akt信号通路的关键分子PI3K、Akt等则均表达下调。五、结论1.构建了高质量的A.coerulea基因组,金属蛋白酶家族结构域在A.coerulea及近缘物种间相对保守;2.构建了A.coerulea水螅体变态发育的物理和化学诱导体系,使用5-甲氧基-2-甲基吲哚作为化学诱导剂比低温诱导具有更高且稳定的诱导效率;3.在整体水平上来看,毒素表达总体稳定,但就单个毒素分子而言,每一种都有其不同的变化特征;4.A.coerulea变态发育过程中整体动物毒性、溶血活性、金属蛋白酶和磷脂酶活性都存在着动态变化的现象;5.金属蛋白酶抑制剂能够延缓A.coerulea水螅体变态发育早期横裂的发生,减少蝶状体产生的数量;磷脂酶抑制剂仅能影响变态发育前24小时的横裂率;6.毒素分子在变态发育过程中发挥重要作用,环境变化如温度下降可能同步激活MAPK和抑制PI3K-Akt两条信号通路,上调金属蛋白酶表达而最终影响A.coerulea变态发育早期横裂的发生。