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一、研究背景与目的 水母生活在高盐、高压、低温、低光照和低氧含量的特殊生境中,近年来水母暴发致使频繁发生蜇伤事件而引发社会关注,但对于水母蜇伤尚未有特异性药物可以进行有效的治疗,这严重威胁到了沿海人民的生命和财产安全。在已报道的有毒生物和哺乳动物中,一方面磷脂酶A2（Phospholipase A2,PLA2）作为主要毒性成分引起受害者体内炎症风暴并产生致死效应,另一方面PLA2的作用产物几乎参与了所有细胞的代谢活动,是人类多种慢性疾病和癌症的主要诱因之一。虽然PLA2也作为水母毒素的主要成分之一常有报道,但鉴定方法不高效、毒素成分和毒性不明了、缺乏特异性治疗药物或手段是目前水母蜇伤防治领域面临的主要问题。因此,我们首先利用转录组和蛋白组技术及体内外毒性评价手段揭示海蜇（Rhopilema esculentum）水母的毒性,其次利用蛋白质质谱技术明确海蜇水母的毒素成分及其分布同时重组表达海蜇水母中的重要PLA2蛋白并探索其介导海蜇毒素发挥毒性作用的机制,最后基于目前的PLA2抑制剂、抗氧化剂和“医学气体”探索治疗海蜇蜇伤的有效策略并为研究新型治疗药物提供思路。二、研究方法 第一部分:海蜇水母转录组和蛋白组的构建与触手提取物（Tentacle Extract,TE）的制备及其毒性评价1.构建转录组和蛋白组:提取海蜇触手的总RNA和蛋白质,质量控制合格后进行高通量测序及质谱分析以构建海蜇触手组织的转录组和蛋白组数据库;与已报道水母进行形态学比对、序列比对和进化树分析完成海蜇的物种鉴定;2.TE的制备:剪下海蜇触手,在4℃下持续搅拌72 h后经200目筛过滤,滤液经4℃,1,000g下离心15 min,取上清液在1×PBS中过夜透析后即为TE。TE的毒性评价:小鼠随机分为TE组和Control组,分别尾静脉注射不同浓度的TE（0.9～8.6 mg/kg）和1×PBS,观察并记录16 h内各小鼠的症状和死亡时间,并计算其半数致死剂量（Lethal Dose of 50%,LD50）;选取 LD50 的 TE（2 mg/kg）和 1 ×PBS 分别注射小鼠,4～6 h后,分别进行血液学指标测定和心脏、肝脏和肾脏的病理学检查;小鼠左右脚掌分别皮内注射50 μL不同浓度的TE（5～40 μg/只）和1 × PBS作为TE组和Control组,测量并记录小鼠48 h内脚掌的厚度变化并计算肿胀百分比;分别选取20 μg和40 μg TE组及Control组12 h和48 h的脚掌进行病理学检查;100 μL红细胞悬液（Red Blood Suspension,RBS）中分别加入10 μL不同浓度的TE（0～78μg/mL）,加入10 μL皂素（Saponin,S）（25 μg/mL）作为阳性对照,于37 ℃下孵育1 h通过OD415计算TE对红细胞的溶血活性;70 μL Raw 264.7细胞悬液中分别加入30 μL不同浓度TE（0～200μg/mL）于37℃下孵育2 h通过OD450计算TE的细胞毒性;将不同质量比的TE:纤维蛋白原（Fibrinogen,Fg）（μg:μg）（0:1～1:0）于37℃下孵育16 h后利用蛋白电泳和ImageJ软件进行蛋白条带分离和灰度值统计,计算TE对Fg的降解程度即蛋白酶活性;向含有25 μL 4-硝基-3-（辛烷氧基）苯甲酸（4-Nitro-3-（octanoyloxy）benzoic acid,NOBA）的缓冲液中加入 25 μL 不同浓度的 TE（0～86 μg/mL）于37℃下孵育1 h通过OD405计算TE对NOBA的降解程度即PLA2活性。第二部分:海蜇TE中PLA2成分的筛选及其毒性作用机制研究3.构建TE毒素库:利用本地Blast工具用海蜇转录组和蛋白组数据库与UniprotKB毒素数据库进行序列比对以构建海蜇触手毒素库,并对筛选出的毒素基因和蛋白根据其注释进行分类统计;构建TE-红细胞膜模型:按照溶血活性测定的方法,分别用TE（78 μg/mL）和 1×PBS 与 RBS 孵育后,在4℃,16,000 g 下离心 30 min,沉淀经1 × PBS清洗后再次离心,将沉淀进行质谱分析后与TE毒素库进行序列比对并进行分类统计,以筛选TE中与膜发生相互作用的毒素成分,尤其是PLA2成分。4.PLA2蛋白的表达:对红细胞膜模型中筛选出的PLA2蛋白（PLA2-Ⅰ和PLA2-Ⅱ）进行体外重组表达和纯化以得到单一成分的纯蛋白。PLA2蛋白的毒性评价:具体方法同上TE的毒性评价,用PLA2-Ⅰ/Ⅱ代替TE。尾静脉注射不同浓度的PLA2-Ⅰ/Ⅱ（3 mg/kg）;溶血活性测定加入不同浓度的PLA2-Ⅰ/Ⅱ（0～150 μg/mL）;细胞毒性测定加入不同浓度的PLA2-Ⅰ/Ⅱ（0～100 μg/mL）;PLA2活性测定加入不同浓度的PLA2-Ⅰ/Ⅱ（0～30 μg/mL）。PLA2蛋白的结构分析:利用蜂毒 PLA2（Bee venom PLA2,BvPLA2）（PDB|1POC|A）为模板对PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白进行序列比对、3D结构模拟和进化树分析。5.PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白与Raw 264.7细胞的免疫荧光:根据染料试剂盒要求按照上述细胞毒性测定的方法,分别用10 μtg/mLPLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白和1×PBS与细胞进行孵育后对细胞膜、细胞核和PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白进行染色观察并拍照;PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白和TE对Raw 264.7细胞的转录组测定:具体方法同上述细胞毒性测定的方法,PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白（10 μg/mL）,TE（2 μg/mL）和1 ×PBS分别处理细胞后,利用转录组学技术分别检测它们对Raw 264.7细胞基因表达情况的影响;TE对小鼠心、肝和肾脏的转录组测定:具体方法同上述尾静脉注射,TE（2 mg/kg）和1×PBS分别处理小鼠后,利用转录组学技术分别检测它们对小鼠心脏、肝脏和肾脏的基因表达情况的影响。6.PLA2抑制剂拮抗PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白的PLA2活性测定:向含有20 μL NOBA的缓冲液中加入20 μL 10μg/mL的PLA2-Ⅰ/Ⅱ和10 μL不同浓度的达普拉缔（Darapladib,DP）（0.01 nM～6 μM）或喹吖因二盐酸盐（Quinacrine dihydrochloride,QD）（0.01 nM～100 μM）于37℃下孵育1 h通过OD405计算DP和QD对PLA2-Ⅰ/Ⅱ的PLA2活性的抑制程度。PLA2抑制剂与PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白的分子对接分析:利用AutoDock 4.2.6,AutoDockTools 1.5.6 和 Python 2.5 进行了 QD-PAL2-Ⅰ/Ⅱ、DP-PAL2-Ⅰ/Ⅱ 之间的分子对接,且使用PyMol 2.4.1软件进行结果展示。第三部分:PLA2抑制剂及分子氢对海蜇TE毒性的拮抗效应研究7.PLA2抑制剂拮抗TE的毒性评价:具体方法同上TE的毒性评价。尾静脉注射和血液学检测中,随机将小鼠分为TE组、DP-TE组、QD-TE组（其中TE、DP和QD的终浓度分别为2 mg/kg、0.5 mg/kg和0.3 mg/kg）和Control组（1×PBS）;脚掌皮内注射模型中,随机将小鼠分为TE组、DP-TE组、QD-TE组,TE终浓度为20 μg/只,DP或QD终浓度分别包括100 μM、250 μM和1,000 μM;分别选取TE组、1,000μM DP-TE组、100 μM QD-TE组和Control组的脚掌进行12 h和48 h的病理学检查;溶血活性测定中,90 μL RBS中分别加入10 μL 40μg/mL的TE和10 μL不同浓度的DP（0.1 nM～15 μM）或QD（0.1 nM～100 μM）;细胞毒性测定中,60 μL细胞悬液中分别加入30 μL 10μg/mL的TE和10 μL不同浓度的DP（0.1 nM～15 μM）或QD（0.1 nM～100 μM）;蛋白酶活性测定中,将DP和QD分别与TE混合后孵育,其中DP和QD的终浓度分别为0.5mg/mL和0.3mg/mL;PLA2活性测定方法同PLA2抑制剂拮抗PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白的PLA2活性测定,DP终浓度分别为0.01 nM～6μM,QD 为 0.01～100μM。8.抗氧化剂拮抗TE的毒性评价:具体方法同上PLA2抑制剂拮抗TE的毒性评价。脚掌皮内注射模型中,随机将小鼠分为TE组、丹酚酸B-TE（Salvianolic acid B-TE,SAB-TE）组和分子氢-TE组,TE终浓度为20μg/只,SAB终浓度包括100 μM、250μM和1,000 μM,腹腔注射分子氢（H2+IP）)组氢气终浓度为1.5 ppm,混合注射脚掌（H2+Mix）组为0.75 ppm。细胞毒性测定中,方法同TE的细胞毒性测定,一组放入普通培养箱,另一组放入氢气培养箱。三、研究结果 1.电泳凝胶及浓度检测显示成功提取了海蜇触手的总RNA和蛋白质,其中RNA的OD260/OD280在2.0左右,RNA条带完整且明亮,蛋白质量合格,蛋白条带清晰且无降解;共获得29,401个unigenes和3,383个蛋白质,它们的长度分布、表达量及GC或分子量分布集中且符合建库标准;海蜇的形态结构与已报道的R.esculentum一致,从构建的数据库中筛选到一条注释为线粒体DNA细胞色素c氧化酶亚单位Ⅰ（mtDNA Cytochrome c Oxidase Subunit Ⅰ,COI）的 TRINITYDN9273c0g2 序列,序列比对和进化树分析都表明其与R.esculentum的相似度最高,因而该水母被鉴定为 R.esculentum;2.尾静脉注射模型结果显示TE在0～8.6 mg/kg范围内对小鼠生存状态的影响呈现剂量依赖效应,TE尾静脉注射小鼠的LD50为2.0 mg/kg;血液学指标测定结果表明TE造成小鼠血液中心脏、肝脏和肾脏指标的显著升高或降低;病理切片显示TE造成心脏、肝脏和肾脏的水肿、充血和出血等;脚掌皮内注射TE呈现时间及浓度依赖性水肿,脚掌棘细胞有内外水肿、真皮浅层毛细血管有扩张和炎症细胞浸润现象;溶血活性和细胞毒性检测实验结果表明TE对红细胞和Raw 264.7细胞呈现剂量依赖性的毒性;酶活力测定实验表明TE具有剂量依赖性的蛋白酶活性和PLA2活性;3.构建的海蜇TE毒素库表明海蜇转录组中有370个与毒素相关的基因,同时在蛋白组中有182个相应的毒素蛋白,其中在基因水平和蛋白水平分别鉴定到12和5个PLA2;TE-红细胞膜模型显示TE与膜相互作用的蛋白中属于毒素的有62种,其中有 2 种 PLA2,分别是 PLA2-Ⅰ 和 PLA2-Ⅱ;4.蛋白凝胶示意图表明这两个蛋白在体外成功表达和纯化;PLA2的毒性评价结果表明PLA2在0～30 μg/mL浓度范围内,在动物和细胞水平未展现出明显的毒性效应,PLA2活性则呈现蛋白剂量依赖性的特征,PLA2-Ⅱ的活性强于PLA2-Ⅰ;PLA2的结构分析表明PLA2-Ⅰ和PLA2-Ⅱ与BvPLA2（PDB|1POC|A）之间有很高的序列和结构同源性;5.细胞免疫荧光结果显示PLA2蛋白作用于细胞膜上,而非穿膜进入细胞内部发挥作用;转录组数据表明PLA2-Ⅰ/Ⅱ处理的细胞富集程度最高的集中在与炎症相关的通路上,包括 TNF signaling pathway、IL-17 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway 与 MAPK signaling pathway;TE同样引起了细胞和整体动物水平的炎症反应;6.PLA2抑制剂对PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白活性的拮抗实验表明DP可以有效抑制PLA2-Ⅰ和PLA2-Ⅱ的PLA2活性,而QD则无显著抑制效果;PLA2抑制剂与PLA2-Ⅰ/Ⅱ蛋白的分子对接分析结果显示PLA2-Ⅰ/Ⅱ分别与配体DP和QD之间有不同程度和形式的作用力,其中PLA2-I-QD有1个氢键而PLA2-Ⅱ-DP有3个氢键;7.PLA2抑制剂拮抗TE的尾静脉注射结果显示DP和QD可以显著提高小鼠生存率;血液学指标检测结果证明DP和QD可以显著改善由TE引起的血液学指标的异常,甚至恢复至正常水平;病理切片显示DP和QD均可以改善TE带来的脏器损伤,且DP的改善效果更好;脚掌皮内注射表明DP可以显著降低小鼠脚掌的肿胀百分比,且具有剂量依赖性,QD则无明显效果;同时病理切片显示DP和QD可以明显改善TE引起的小鼠脚掌的水肿和炎症反应;PLA2抑制剂对TE的溶血活性和细胞毒性实验结果表明DP和QD均可以有效拮抗TE引起的红细胞溶血活性和Raw 264.7细胞毒性并提高其存活率;酶活力实验结果表明DP和QD均有效抑制了 TE的蛋白酶和PLA2活性;8.抗氧化剂拮抗TE的毒性评价结果证明SAB可以显著降低小鼠脚掌的肿胀百分比;腹腔注射富氢水（TE+H2IP）和富氢水与TE混合（TE+H2 Mix）注射脚掌的两种给氢方式均有效降低了小鼠脚掌的肿胀百分比;病理切片证明SAB和分子氢均有效的改善了 TE引起的棘层和基底层水肿,真皮层毛细血管扩张和胶原分离断裂的情况;细胞毒性实验显示氢气培养箱内Raw 264.7细胞的增殖率和TE对Raw 264.7细胞的LD50均显著高于在普通培养箱内的细胞。四、结论 综上所述,海蜇TE在动物水平和细胞水平产生明显的毒性效应并具有较强的酶活性;TE中毒性成分复杂多样,其中PLA2是海蜇TE中作用于细胞膜的潜在活性成分,体外重组表达的海蜇PLA2蛋白具有PLA2活性和结构特征同海蜇TE一样可以刺激细胞产生炎症因子并诱导体内多脏器同步炎症反应;PLA2抑制剂（DP和QD）能够有效抑制TE的体内外毒性,可能是通过抑制PLA2活性实现的;抗氧化剂（SAB和分子氢）可能通过减轻TE诱导的体内和细胞内损伤而发挥保护作用。总之,PLA2在海蜇毒性作用过程中发挥着重要的作用,可能是TE诱导体内多脏器及细胞内炎症反应的重要毒素之一,特定毒素的抑制剂、抗氧化剂和“医学气体”可能是治疗海蜇甚至水母蜇伤的有效策略。