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背景:血管衰老是人类衰老的重要方面之一,与人体整体的健康息息相关。血管衰老始于生命早期,从临床角度来看,它可以定义为一个逐渐发展的过程。其特征是血管结构和功能的逐渐变化,导致动脉顺应性降低和动脉硬化增加以及血管机能的逐渐丧失[1],与各类心血管疾病(CVD)密切相关[2]。血管衰老的机制包括氧化应激、基因组不稳定性、慢性低度炎症、端粒缩短和细胞衰老[2]。细胞衰老是一种在各种压力下不可逆的细胞周期停滞状态,从最初作为体外现象的出现逐渐转变为体内衰老的细胞标志[3]。血管平滑肌细胞(VSMC)作为血管结构的关键组成部分之一,其衰老会促进动脉粥样硬化的发生[4],并与其他疾病包括高血压、糖尿病等有很强的相关性。铁死亡是一种新型的、受调控的细胞死亡形式,于2012年被正式提出。不同于如凋亡和坏死等其他细胞死亡类型[5],其特征是亚铁(Fe2+)驱动的致死性脂质活性氧(ROS)的大量积累[5,6]。虽然精确的信号转导尚未完全阐明,但已证实铁死亡受多层信号通路和程序的调节,包括抗氧化酶[6,7],脂质过氧化产物[8,9],能量的利用[10],线粒体功能[11],干扰素相关基因[12]等。铁死亡有助于缺血或药物诱发的心肌病[13],急性肾功能衰竭[14]和动脉粥样硬化[15]。然而,人们对铁死亡在血管老化中的作用知之甚少,并且之前有研究中发现,衰老的血管上有铁的沉积,有脂质沉积,并伴有大量ROS生成,这恰恰与铁死亡的主要进程有着很高的相似度[16]。因此我们课题组假设:铁死亡可能参与了血管衰老的过程。实验方法:临床样本:从临床上患颈动脉体瘤的中年患者(<50岁)和老年患者(>70岁)中获取正常颈动脉组织。动物水平上:使用两种衰老模型。一种是饲养C57BL/6J小鼠至24月龄作为自然衰老模型,另一种是使用血管紧张素2(Ang II,400ng/kg/min)+博来霉素(Bleo,40 ng/kg/min)联合刺激诱导形成血管应激衰老模型。并在应激模型上使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1探究铁死亡对血管衰老的影响;构建GPX4基因敲入小鼠评估铁死亡对血管衰老的影响。细胞水平上,使用人原代血管平滑肌细胞(h VSMCs)和小鼠主动脉血管平滑肌细胞系(MOVAS),分别构建复制型衰老和应激衰老模型开展研究。实验结果:1、自然衰老血管和应激诱导的衰老血管中存在铁死亡的激活。我们分别在组织和细胞衰老模型中进行铁死亡相关指标的检测。首先对比中年(<50岁)和老年(>70岁)受试者的颈动脉血管,发现促铁死亡因子ALOX15、ACSL4、Fe2+在老年受试者血管中均出现升高。其次在动物模型上,我们使用两种血管衰老模型,一种是自然衰老C57BL/6J小鼠(24月龄),一种是使用Angiotensin II(Ang II,400 ng/kg/min)+bleomycin(Bleo,40 ng/kg/min)诱导的血管应激衰老小鼠,发现与对照C57BL/6J小鼠相比,两种衰老小鼠血管中均出现铁死亡激活。在细胞模型上,我们同样使用两种细胞衰老模型,一种提取原代人血管平滑肌细胞(h VSMCs),并传代至35代形成复制型衰老细胞,另一种是在小鼠VSMCs中使用Ang II(0.1μM)+bleomycin(100 n M)诱导细胞应激衰老,两者与对照相比均出现铁死亡的激活。2、我们在小鼠VSMCs中给予铁死亡激活剂RSL3。结果发现,非细胞毒性剂量(0.5μM)的RSL3能够诱导VSMCs衰老。同时我们用诱导铁死亡细胞的培养液和衰老细胞的培养液分别加入到正常的VSMCs培养基中,结果表明铁死亡促进了VSMCs的衰老,而衰老的VSMCs似乎不能诱导铁死亡。3、我们在动物应激衰老模型上使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1,结果发现Liproxstatin-1阻断了小鼠血管中铁死亡,减少了血管氧化应激,减少了NAD+损失,减轻了血管的重塑/硬化,抑制衰老表型并减缓血管衰老进程。4、我们在体外培养的小鼠VSMCs衰老模型上使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1,结果发现Liproxstatin-1阻断了VSMCs中铁死亡,减少了细胞中的不稳定铁池(LIP),降低了细胞中氧化应激,减少了NAD+损失,并且减缓了细胞衰老进程。5、我们构建了GPX4基因敲入小鼠,并使用同窝出生的野生型(WT)小鼠作为对照。两组小鼠饲养24个月成自然衰老(24月龄),对比发现GPX4的敲入能够抑制老年小鼠血管中铁死亡,并且减缓了小鼠血管衰老进程、减少衰老相关的NAD+损失以及减轻老年小鼠血管的重塑/硬化。6、在GPX4基因敲入小鼠和同窝出生的野生型(WT)成年小鼠中(8周龄)使用血管紧张素II(Ang II,400 ng/kg/min)和博来霉素(Bleo,40ng/kg/min)联合刺激,诱导形成血管应激衰老模型。对比发现GPX4的敲入能够抑制血管铁死亡,减缓小鼠血管应激相关的NAD+损失以及减缓小鼠血管的衰老进程。7、在体外培养的小鼠VSMCs细胞实验中,我们在应激诱导的衰老细胞中通过转染质粒过表达GPX4后,发现能够减轻衰老小鼠VSMCs中的氧化应激、NAD+损失及衰老程度。结论:在本研究中,我们证明了铁死亡在血管衰老和应激条件下被全面激活。并证实从药理学(使用化学抑制剂liproxstatin-1)或基因角度(构建GPX4敲入小鼠)阻断铁死亡,可延缓血管衰老,并且减轻血管系统中与衰老和压力相关的NAD+损失和血管硬化。