成纤维细胞是皮肤真皮层的主要结构成分。研究表明过量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）诱导成纤维细胞衰老,降低细胞外基质分泌,而另有研究表明低水平ROS有利于细胞信号转导,能够促进成纤维细胞增殖。过氧化氢（Hydrogen peroxide,H₂O₂）的强氧化性能有效诱导细胞产生ROS,被广泛应用于细胞氧化应激、细胞衰老和细胞增殖的研究中。但不同浓度H₂O₂诱导皮肤成纤维细胞发生衰老的时间点以及在细胞在衰老过程中与细胞衰老和增殖相关因子的表达规律却鲜有研究。将SD大鼠的乳鼠尾尖剪碎,使用组织团块法获得皮肤成纤维细胞并传至三代,应用免疫荧光法鉴定分离培养的大鼠皮肤成纤维细胞。使用细胞培养液配制不同浓度的H₂O₂持续刺激三代皮肤成纤维细胞,根据细胞衰老β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）和CCK-8结果筛选出的H₂O₂浓度,将成纤维细胞分为4组:0μM、50μM、100μM和500μM。用4种浓度H₂O₂分别刺激成纤维细胞12h,每4h更换一次处理液,并在0h、4h、8h和12h四个时间检测相应指标。用活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）试剂盒检测细胞内氧化-抗氧化情况;采用Western blot检测成纤维细胞内p16、p21、p53、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGFβ1）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT enhancer binding protein,C/EBPβ）和γH2A.X的表达水平;细胞计数法和流式细胞技术检测细胞增殖和细胞周期;使用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测衰老相关分泌表型典型因子白细胞介素-1α（Interleukin-1α,IL-1α）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）的分泌情况;最后采用免疫荧光法测定成纤维细胞DNA损伤指示蛋白γH2A.X。成纤维细胞的形态学观察和免疫荧光结果确定成功分离培养原代大鼠皮肤成纤维细胞。0μM组的各项指标在各个时间点基本稳定,细胞形态良好,γH2A.X不表达。与0μM组相比,50μM组的ROS水平、CAT和SOD活力在12h内持续上升;p16、p21、p53表达量在0h-8h基本平稳,在12h有所升高;TGFβ1、C/EBPβ持续升高,G2+S期细胞比例不断增加,细胞数量稳定增加;IL-1α分泌量、IL-6和IL-8的分泌量在0h-8h基本稳定,12h显著增加;γH2A.X在12h开始表达。100μM组的ROS水平不断升高,CAT和SOD活力在0h-4h上升,4h-12h持续下降;p16、p21、p53表达量持续升高;TGFβ1的表达量在0h-8h升高,8h-12h降低,C/EBPβ表达量在0h-8h迅速升高并稳定在较高水平,G2+S期细胞比例先增大后减小,细胞数量先增加后保持不变;IL-1α、IL-6和IL-8的分泌量不断上升,在12h显著高于50μM组;γH2A.X在8h开始少量表达,细胞核不断增大。500μM组的ROS水平、CAT和SOD活性均在4h显著升高,而4h-12h之间不断下降;p16、p21、p53表达量持续上升,显著高于其他三组,TGFβ1和C/EBPβ表达量持续减少,细胞被阻滞在G1期,8h和12h难以进行正常流式细胞周期检测,细胞数量不断减少;IL-1α、IL-6和IL-8的分泌量在0h-4h迅速上升而4h-12h不断下降;γH2A.X在4h开始出现,表达量不断增加,细胞核在4h明显增大,4h-12h逐渐固缩。实验结果表明,H₂O₂对成纤维细胞的影响具有剂量与时间依赖性。浓度越高、作用时间越长越容易导致细胞的衰老甚至死亡,相反,时间短、浓度低则发挥促进增殖的作用。