【摘 要】
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目的:构建一种新型RNA适配体生物传感器,以便可以更灵敏、特异、高效地检测复杂生物体系内羧酸酯酶2A(Carboxylesterase 2A,CES2A)的活性,同时运用此方法构建CES2A中药调控剂的高通量筛选体系。方法:我们创新性地提出了配体荧光分子结构改造策略来构建检测CES2A活性的新型适配体传感器。在配体荧光分子与RNA适配体结合的关键位点进行修饰,破坏其与RNA适配体的亲和性。当目标水
【基金项目】
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[2017YFC1700200]“中医药现代化研究”重点专项; [81773687],国家自然科学基金;
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目的:构建一种新型RNA适配体生物传感器,以便可以更灵敏、特异、高效地检测复杂生物体系内羧酸酯酶2A(Carboxylesterase 2A,CES2A)的活性,同时运用此方法构建CES2A中药调控剂的高通量筛选体系。方法:我们创新性地提出了配体荧光分子结构改造策略来构建检测CES2A活性的新型适配体传感器。在配体荧光分子与RNA适配体结合的关键位点进行修饰,破坏其与RNA适配体的亲和性。当目标水解酶CES2A将修饰基团水解后,使配体荧光分子恢复其原有结构,与适配体结合形成稳定复合物并产生荧光。于是,根据配体分子DFHBI(3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮)与RNA核酸适配体Broccoli特异性结合发出明亮荧光的性质,基于CES2A底物偏好性,合成了八种以DFHBI为母核的羧酸酯类衍生物。通过单酶体外孵育筛选考察了CES2A催化八种酯类配体衍生物的催化速率及底物特异性,筛选得到了高特异性、高灵敏度响应的配体荧光团T-DFHBI作为分子识别元件,同时适配体Broccoli作为荧光信号扩增元件,来检测505 nm处的荧光信号。经过相关光学、化学属性评价后,实现了复杂生物样本中的CES2A活性成功检测。在中药抑制剂筛选方面,我们用RNA适配体传感器与商业化的CES2A的活性检测探针FD进行了对比,比较两种方法测得半数抑制浓度(IC50)值的异同。结果:八种酯类配体分子衍生物中,T-DFHBI(3号衍生物)特异性最佳,CES2A介导的水解产物与核酸适配体结合后可以在λem=505 nm处检测到荧光信号,并且T-DFHBI有着稳定的化学性质,生理条件下30 min内并不会自发水解。传感器检测CES2A活性的相关实验表明,T-DFHBI具有较高检测灵敏度(LOD=8.81 ng/m L)、极高的特异性、较强的抗干扰能力等优势。T-DFHBI的酶动力学行为表征实验结果表明,T-DFHBI在人肝微粒体以及在CES2A单酶中动力学行为和Km值相近,分别为2.37μM和5.34μM,表明CES2A是人肝微粒体水解T-DFHBI中的主要参与酶。十二例个体人肝微粒体的CES2A活性检测中,不同个体间的CES2A活性表现出了3~4倍差异,这与之前文献报道相吻合,并且与商业化探针FD相比,具有较好的相关性(R~2=0.94)。以上结果表明该检测方法可以真实有效地检测复杂生物样本中的CES2A活性。中药抑制剂的筛选结果同时表明,RNA适配体传感器检测方法测得的IC50值与FD测得的IC50值较为相近,提示我们构建的新型CES2A的中药抑制剂筛选体系有效可行。结论:总之,我们构建了一种可用于复杂生物样本中CES2A活性检测的新型RNA适配体生物传感器。该检测方法将有助于CES2A相关生物标志物的发现以及为CES2A相关的新药研发,药物-药物相互作用的更深层次了解提供了新思路。该生物传感器也为进一步探究CES2A的生物学功能以及高效发现CES2A的调控剂提供了有力工具。此外,修饰配体荧光分子使RNA配体荧光淬灭策略也为开发基于RNA荧光适配体的基因编码荧光生物传感器提供了新的可能性。
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