农杆菌介导的苜蓿遗传转化体系的建立与优化

来源 :东北师范大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:han8349
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盐碱胁迫是限制作物生产最严重的非生物胁迫因素之一。许多研究者正在培育耐盐作物新品种来适应和利用盐碱地。然而,植物耐盐能力是一个非常复杂的生理性状,传统育种很难大幅度的提高植物的耐盐能力,通过基因工程手段能够很好的解决这个难题。目前,随着分子生物学及生物技术的迅速发展,已经发现了一些与耐盐相关的新基因,并获得了耐盐能力相对提高的转基因植株。紫花苜蓿(Medicago sativa L)为世界范围内广为种植的多年生优质豆科牧草。利用基因工程技术提高苜蓿耐盐性,获得抗逆新品系,将对我国牧草业发展有重要的现实意义。本研究的目的是建立并优化苜蓿高频再生植株转化体系,并将角碱蓬Na<+>/H<+> antiporter基因导入紫花苜蓿公农-1号中,为利用生物技术改良苜蓿品质搭建基础平台。 基因型是限制遗传转化的关键因素之一,选择高频再生基因型是苜蓿遗传转化成功的保障,本试验从7份紫花苜蓿供试材料中成功的筛选到一个具有高频再生潜力的基因型——公农-1号。 建立了苜蓿胚性愈伤悬浮培养系统,对影响悬浮培养的两个主要因子一胚性愈伤接种量和悬浮培养转速进行优化,确定了本实验悬浮培养最佳接种量为3g/40ml,悬浮培养理想转速为120r/min。 建立超声辅助农杆菌介导苜蓿胚性愈伤遗传转化系统,以悬浮胚性愈伤作为实验材料,应用超声波辅助农杆菌介导法,成功的建立了苜蓿遗传转化体系。在实验过程中,优化了影响苜蓿遗传转化的因素,包括超声波最佳处理时间(8s)、AS最佳使用量(100umol/L)、最佳共培养时间(5d)、卡那霉素最佳抗性浓度(50mg/L)。 转基因植株的分子检测,在本试验中成功的获得了15株抗性植株,PCR检测证实外源基因已经整合到苜蓿的基因组中。 本实验成功的建立了苜蓿体胚高频再生体系,在此基础上通过农杆菌转化法成功的筛选到转基因植株,为苜蓿遗传转化的理论和应用研究提供了有效的方法。
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