研究背景:狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起狂犬病在人和动物间发生,造成宿主100%的死亡,严重威胁公共卫生安全。狂犬病病毒颗粒内部核心组成为核蛋白与病毒RNA结合形成核衣壳复合物,其中核蛋白除作为狂犬病病毒颗粒的重要组成部分之外,还承担着调控病毒复制,激活宿主免疫的功能,也可用于体外检测、病毒分型等。获得高纯度的核蛋白是开展基础科研和应用研究的基础,目前已有学者使用真核系统对核蛋白进行重组表达,但成本较高,操作复杂,也难以获得大量的核蛋白,其他学者使用原核系统对核蛋白进行表达,多以包涵体的形式出现,有人尝试使用融合标签或对其中部分序列进行截短表达,但难以获得具有生物学活性的核蛋白。本实验在CTN-1株的基础上对核蛋白编码序列进行优化,采用不同的表达条件促进核蛋白的可溶性表达,以期获得高产量、高纯度的具有生物学活性的核蛋白,并对其进行初步应用。研究方法:1、提取狂犬病病毒CTN-1株病毒总RNA,RT-PCR扩增出狂犬病病毒CTN-1株全长N基因,并在基因两端添加NdeI和XhoI位点,构建重组质粒pET-43.1a-NP。在大肠杆菌BL21（DE3）株诱导表达,使用SDS-PAGE和Image Lab软件分析其表达结果。2、重组质粒pET-43.1a-NP在大肠杆菌中未有表达,对N基因序列进行优化,通过替换稀有密码子,调整GC含量,优化mRNA的二级结构,人工合成基因后构建pET-43.1a-CTN-NP（Opti）表达质粒。通过改变诱导条件,优化诱导时间,提高核蛋白的表达产量。按照最佳表达条件大量诱导大肠杆菌,裂解和超声破碎诱导后菌液,离心后分别收集上清和沉淀,对沉淀使用盐酸胍溶解,使用固定化Ni2+螯合层析纯化。通过改变缓冲液的配方,在低温下对重组核蛋白进行复性。3、为了获得狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,对其诱导温度、IPTG浓度和诱导时间进行摸索。对可溶性表达的重组狂犬病病毒CTN-1株核蛋白使用Ni2+螯合层析纯化,通过电泳分析其纯化效果并进行Western Blot验证其反应原性。将可溶性的核蛋白、复性的核蛋白、阴性对照、阳性对照免疫小鼠,采集小鼠血清,用狂犬病核蛋白抗体检测试剂盒检测重组核蛋白免疫原性。4、以本研究所表达的具有反应原性和免疫原性的核蛋白为基础,通过对狂犬病病毒CTN-1株核蛋白最适包被浓度、包被温度、包被时间、封闭液和封闭条件以及二抗浓度的优化,初步建立可检测狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法,并用已知样本初步验证该方法的实用性和重复性。研究结果:1、通过构建狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白的重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,SDS-PAGE电泳发现诱导后菌液与诱导前菌液表达无明显差别,需要进一步对基因序列进行优化以提高表达产量。2、对狂犬病病毒CTN-1株N基因进行优化,优化序列与原始序列相比GC含量提升至51.5%,61个稀有密码子全部进行了替换,N基因的密码子适应指数（CAI）值由0.19提升至0.95。经过软件分析,优化后序列的mRNA二级结构更稳定。3、优化后狂犬病病毒CTN-1株N基因在大肠杆菌中诱导表达,在50 kD左右出现明显蛋白条带,表达产量明显提升。为了进一步提高核蛋白表达产量,对诱导时间和大肠杆菌OD值进行优化,发现当OD600为0.5、诱导5 h时为最佳表达条件,产量可达到32.3%。大肠杆菌大量诱导表达后,核蛋白以包涵体表达,使用基于Ni2+的螯合层析进行纯化,纯化后蛋白纯度为95.8%。通过对诱导剂使用浓度、诱导温度和诱导时间的优化,可以实现在16℃条件下过夜诱导,得到可溶性表达的核蛋白,进行纯化后获得了高纯度的核蛋白。4、狂犬病病毒CTN-1株重组核蛋白经Western Blot检测,在50 kD左右出现明显条带,说明核蛋白能够被核蛋白的特异性抗体结合,具有良好的反应原性。将重组核蛋白免疫小鼠后采集血清,抗体效价可达到1:320,证明核蛋白具有良好的免疫原性。5、已知血清样本的验证结果提示,本研究所建立的间接ELISA定性检测结果的阴阳性符合率为100%,批内与批间OD450值的变异系数均低于10%。研究结论:本实验在狂犬病病毒CTN-1株核蛋白原始序列表达产量较低的情况下,通过对狂犬病病毒CTN-1株核蛋白进行密码子优化,构建了重组表达质粒pET-43.1a-CTN-NP（Opti）,并通过降低诱导温度和延长诱导时间等条件实现了核蛋白在大肠杆菌表达系统中大量的可溶性表达。Western Blot和动物试验结果显示,本实验所表达的核蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。在此基础上,本研究初步建立了可检测抗狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法。