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肿瘤是威胁人类生命健康重大问题,而作为肿瘤的主要部分的肿瘤细胞是一种变异的细胞,是产生癌症的病原。就目前而言,从自然界的资源中开发出的抗癌药物中,大多数都来自动植物的次生代谢产物及其它小分子化合物。而近些年来,有关于生物大分子的活性的研究逐渐引起了人们的广泛关注。香菇是我国十分珍贵的药食两用真菌,自古以来都深受人们青睐,所以自1990年开始,根据当时国际对香菇药用价值的研究,本课题组通过采用生物工程发酵技术对6株香菇进行菌丝进行发酵,发现其中一株菌株经发酵后,其发酵液具有直接抗肿瘤作用。因该菌株是从1991年3月开始进行研究的,因此将其命名为“C91-3”,“C”是英文“China”简称。根据其发酵液中一些蛋白组分在体内外的实验中表现出的诱导细胞凋亡的能力,因此对香菇C91-3菌株进行转录组学的分析。通过在线工具软件Sanger Pfam进行结构域分析,筛选出Latcripin-8。设计其引物,通过利用RACE的技术获得了基因全长,并通过生物信息学软件得到相应的氨基酸序列。目的:通过生物信息学方法对Latcripin-8的基因序列、功能域片段及相应的氨基酸序列进行分析,并对Latcripin-8蛋白的二级结构及三级结构进行在线分析预测。克隆至载体后诱导表达并鉴定。通过生物信息学软件分析预测出的Latcripin-8蛋白的生物学活性功能,采用不同方法检测Latcripin-8蛋白的体外抗肿瘤活性,将香菇C91-3菌株Latcripin-8重组蛋白作用于不同的肿瘤细胞,检测其在体外抗肿瘤方面的效果,为深入研究Latcripin-8蛋白的生物学功能及为其开发成为新型抗肿瘤药物提供方向。方法:（1）从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA并反转录获得c DNA文库,高通量测序获得转录组m RNA,参照其转录组测序的结果及生物信息学比对获得目的序列。RACE技术有能够对目的基因扩增的作用,从而便能得到我们需要的基因全长。经Pfam等数据库比对及生物信息学技术分析后,得到Latcripin-8功能域序列及氨基酸组成,预测其理化性质及其生物学活性。（2）选取p ET32a（+）作为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌E.coli Rosetta-gami中诱导表达。将表达后的蛋白表达产物通过生化技术如SDS-PAGE、Western Blotting等方法进行鉴定。采用带有His标签的磁珠对重组蛋白进行分离纯化,对纯化后的目的蛋白进行分步稀释复性透析,BCA法检测其蛋白浓度。（3）Latcripin-8重组蛋白的抗肿瘤活性的鉴定:CCK8（Cell Counting Kit-8）法测定其对人肺腺癌A549细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌Hepg2细胞及人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制率;并使用显微镜观察经Latcripin-8重组蛋白处理过的细胞与未经处理过的正常肿瘤细胞形态有何区别;采用透射电镜的方法,检测其对SGC-7901细胞形态学的影响;利用流式细胞仪检测技术对SGC-7901细胞的凋亡及细胞周期情况进行检测。结果:通过RACE的方法获得Latcripin-8基因全长,PCR扩增获得功能域序列,经过对Latcripin-8功能域序列分析后发现,该基因序列具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Pkinase）结构域。（2）通过对重组质粒双酶切的方法验证了重组原核表达载体p ET32a（+）-Latcripin-8经NotⅠ和Bam HⅠ两种限制性内切酶酶切后,其条带位置显示了Latcripin-8功的能域基因序列已成功插入。所得蛋白经His标签的磁珠纯化获得单一目的蛋白,表达后的Latcripin-8重组蛋白在SDS-PAGE及Western blot的条带位置也验证了Latcripin-8蛋白的成功表达及纯化。BCA方法测定其蛋白的浓度,得到标准直线方程y=0.0419x-0.002,R~2=0.9982。通过方程计算获得蛋白浓度:1.125mg/m L。（3）CCK8结果显示,目的蛋白Latcripin-8对四种肿瘤细胞均具有一定的增殖抑制活性,其中对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制程度最为明显,并表现出时间和浓度依赖性。当蛋白浓度为200μg/m L抑制率达到最大（约为80%）。经电镜扫描后的图片的结果可知,而经目的蛋白Latcripin-8处理的细胞形态与之前的对照组的细胞相比具有很明显的形态差异。流式细胞术检测结果表明,该蛋白能够诱导SGC-7901细胞凋亡,且其凋亡程度呈现出时间及浓度的依赖关系;细胞周期检测结果显示,Latcripin-8重组蛋白对SGC-7901细胞产生G1期阻滞作用,S期随蛋白浓度增加及作用时间的延长逐渐缩短。即该重组蛋白对人胃癌细胞SGC-7901有明显杀伤作用,能够引起细胞出现凋亡现象。结论:（1）经转录组序列分析后筛选出的香菇C91-3菌株的中具有蛋白激酶活性的Latcripin-8基因,经RACE方法对目的基因扩增后得到了我们需要的基因全长。（2）成功的将Latcripin-8的功能域序列克隆到构建的原核表达载体p ET32a（+）内,构建成重组质粒p ET32a（+）-Latcripin-8,热转化法将该质粒转化至大肠杆菌表达宿主E.coli Rosetta-gami（DE3）中,且证明了重组质粒p ET32a（+）-Latcripin-8能够在大肠杆菌进行表达。带有His标签磁珠纯化法成功对Latcripin-8蛋白进行纯化,分步稀释复性透析法成功复性Latcripin-8蛋白。（3）CCK8法初步证明了Latcripin-8蛋白对人胃癌SGC-7901细胞、人肺腺癌A549细胞、人肝癌Hepg2细胞以及人宫颈癌Hela细胞具有抑制其增殖的作用,且对人胃癌SGC-7901细胞的生长抑制作用最为明显,经投射电镜及流式细胞术技术对其诱导细胞凋亡进行验证。