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目的:本实验检测SERPIND1在卵巢上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织中的表达,并分析SERPIND1与病理参数之间的关系;还检测分析了SERPIND1的相互作用蛋白种类;构建差异表达SERPIND1的上皮性卵巢癌细胞系,探究差异表达SERPIND1对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响及相关调控机制;还对SERPIND1基因启动因子区进行了初步探索,其结果对于卵巢上皮性肿瘤标志物的检测、术后随访及后续治疗等都具有广阔的临床应用前景。研究方法:分别使用免疫组织化学、蛋白印迹等方法检测:SERPIND1在卵巢上皮性肿瘤组织、正常卵巢组织(来源于因宫颈癌手术术中切除的正常卵巢标本)、卵巢癌细胞系中的表达情况,并分析患者临床病理参数与SERPIND1表达间的相关性。通过对113例原发性卵巢上皮性恶性肿瘤患者进行术后随访调查,分析SERPIND1的表达对患者总生存时间、疾病无进展生存时间之间的关系。同时提取卵巢上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织中的蛋白质,通过蛋白印迹法方法检测SERPIND1的表达情况。进一步分析卵巢上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织中SERPIND1在蛋白水平上的表达差异。并分别构建SERPIND1基因过表达卵巢癌细胞系ES-2-SERPIND1-H及对照的细胞系ES-2-SERPIND1-H-Mock,使用小干扰RNA得到瞬时转染细胞系CAOV3-SERPIND1-L、OVCAR3-SERPIND1-L及相应的对照细胞系CAOV3-SERPIND1-L-Mock和OVCAR3-SERPIND1-L-Mock。并通过Real time PCR、蛋白印迹法检测SERPIND1基因转染前后,SERPIND1 mRNAs和蛋白的变化情况。通过划痕试验、Transwell试验分别检测转染前后细胞的迁移和侵袭能力,MTT法检测细胞差异表达SERPIND1前后的增殖能力,PI染色检测差异表达SERPIND1前后细胞周期的变化,Annexin-V-APC/PI或Annexin-V-PE/7AAD双染检测细胞差异表达SERPIND1前后的凋亡能力。通过建立裸鼠皮下移植瘤模型与腹腔移植瘤模型,在体内检测细胞差异表达SERPIND1前后增殖、转移能力的变化情况。蛋白质谱分析上皮性卵巢癌细胞系CAOV3中SERPIND1的相互作用蛋白,并利用免疫共沉淀的方法进行验证。通过蛋白印迹法检测SERPIND1基因差异表达前后,PI3K/AKT信号通路节点蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT以及MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等与细胞迁移、侵袭紧密相关的蛋白的表达情况。最后应用划痕实验、Transwell、MTT实验、Annexin-V-PE/7AAD双染法以及PI染色法检测添加相应通路抑制剂前后的过表达SERPIND1上皮性卵巢癌细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡能力和细胞周期的改变。还通过ChIP实验检测NF-κB1蛋白与SERPIND1的转录调控区的结合;构建NF-κB1基因沉默细胞模型,蛋白印迹法检测NF-κB1基因沉默前后,SERPIND1的变化情况。结果:1、SERPIND1主要在细胞浆中表达,少量于细胞核着色。免疫组织化学染色结果大多呈棕褐色、棕黄色均匀颗粒或片状。SERPIND1在卵巢上皮性恶性、交界性、良性肿瘤和正常卵巢组织的阳性表达率分别是90.40%、62.50%、20.83%及12.50%,强阳性率分别是67.20%、37.50%、16.67%,0.00%。SERPIND1在卵巢上皮性恶性肿瘤组与卵巢上皮性交界性肿瘤组的阳性表达率明显高于卵巢上皮性良性肿瘤组和正常卵巢组(P均<0.05)。根据FIGO分期标准:Ⅲ～Ⅳ期SERPIND1的阳性率、强阳性率(97.0%,85.10%)均高于Ⅰ～Ⅱ期(89.1%,43.5%)(P均<0.05)。低分化组及中分化组SERPIND1的阳性表达率(97.10%,90.90%)及强阳性(67.60%,75.80%)表达率也均高于高分化组(83.30%,50.00%),但无统计学差异(P均>0.05)。淋巴结转移阳性组SERPIND1的阳性表达率及强阳性表达率高于淋巴结转移阴性组,但无统计学意义(100%,82.4%vs.94.6%,76.8%,P均>0.05)。多因素分析提示SERPIND1是卵巢上皮性恶性肿瘤患者预后的独立危险因素(P<0.05),即SERPIND1高表达的患者术后复发可能性更大,生存时间更短。2、SERPIND1过表达后促进卵巢癌细胞系ES-2迁移、侵袭、增殖和G1期向S期转化的能力,并抑制细胞凋亡。抑制SERPIND1表达后会使卵巢癌细胞系CAOV3,OVCAR3产生与之相反的变化,即卵巢癌细胞迁移、侵袭、增殖和G1期向S期转化的能力均降低,而细胞凋亡率增加(P均<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验显示SERPIND1过表达细胞产生的移植瘤生长速率显着高于对照组;SERPIND1过表达细胞产生的移植瘤体积和质量均明显大于对照组。腹腔移植瘤实验发现SERPIND1过表达组有许多腹膜转移性结节,而对照组中很少发现转移性结节(P均<0.05)。蛋白质谱和免疫共沉淀方法得出SERPIND1的相互作用蛋白为Vimentin。3、过表达SERPIND1后发现PI3K/AKT通路中PI3K和AKT的磷酸化比例明显升高,与侵袭相关的MMP2、MMP9、N-cadherin和Vimentin蛋白也均明显升高,而E-cadherin蛋白明显降低(P均<0.05),即促进卵巢癌细胞发生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)。抑制SERPIND1表达后,PI3K和AKT的磷酸化比例明显下降,MMP2、MMP9、N-cadherin和Vimentin蛋白也均明显降低,而E-cadherin蛋白明显升高(P均<0.05),即抑制卵巢癌细胞发生EMT。加入PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)后,ES-2-SERPIND1-H细胞的迁移能力和侵袭能力下降,增殖能力下降,G1期向S期的转化能力下降,抑制凋亡的能力也下降(P均<0.05)。转录因子NF-κB1可与SERPIND1的启动子区的-258～-248位点(GGTGTTTTCCA)以及+131～+141位点(AGGCCTTCCTC)结合;抑制NF-κB1的表达后,SERPIND1的表达也下降。结论:1、SERPIND1在卵巢上皮性恶性肿瘤组织中的表达显著高于上皮性卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织,其高表达提示患者术后复发可能性更大,生存时间更短。2、SERPIND1通过促进PI3K/AKT通路的磷酸化,促进卵巢癌细胞从G1期向S期的转化,促进增殖、迁移、侵袭、EMT,抑制凋亡。3、SERPIND1的相互作用蛋白为Vimentin。4、NF-κB1通过与SERPIND1启动子区结合调控SERPIND1的表达。