【摘 要】
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背景基因转染利用载体传递功能性基因,使靶细胞过/低表达目的基因,从而调控细胞功能,是牙体/骨组织再生的重要研究手段,其关键内容包括靶细胞、载体及基因的选择。人牙髓干细胞(Human dental pulp stem cells,hDPSCs)由于易被分离培养、免疫原性低等特点,不仅是牙体/骨组织再生常用的种子细胞,也是基因转染重要的细胞载体;慢病毒由于可介导基因高效持续表达且无诱导免疫反应风险等优
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背景基因转染利用载体传递功能性基因,使靶细胞过/低表达目的基因,从而调控细胞功能,是牙体/骨组织再生的重要研究手段,其关键内容包括靶细胞、载体及基因的选择。人牙髓干细胞(Human dental pulp stem cells,hDPSCs)由于易被分离培养、免疫原性低等特点,不仅是牙体/骨组织再生常用的种子细胞,也是基因转染重要的细胞载体;慢病毒由于可介导基因高效持续表达且无诱导免疫反应风险等优点,因此被广泛使用;胰岛素样生长因子-1(Insulin-likegrowth factor-1,IGF-1)是可诱导hDPSCs成牙/成骨向分化的生长因子,但IGF-1作用于胞外诱导hDPSCs分化存在蛋白维持时效短等问题,而基因转染可介导目的基因高效稳定表达等优点克服了传统疗法的诸多缺点。目前,尚无利用基因转染调控IGF-1表达水平以探究hDPSCs矿化能力改变的研究,故本实验拟用慢病毒建立过/低表达IGF-1的hDPSCs模型,评估hDPSCs体外成牙/成骨向分化能力,以期为牙体/骨组织再生开发新思路。方法1.hDPSCs的分离培养及鉴定用组织块-酶消化法结合有限稀释法培养hDPSCs,流式细胞仪鉴定细胞表型,并检测hDPSCs克隆形成能力及多向分化能力。2.建立过/低表达IGF-1的hDPSCs模型用过/低表达IGF-1慢病毒转染hDPSCs,基于感染复数(Multiplicity of infection,MOI)筛选最佳感染浓度,通过 qRT-PCR、Western Blot 及 ELISA评估hDPSCs表达IGF-1的效果。3.检测基因修饰后hDPSCs体外矿化能力用CCK-8法检测hDPSCs增殖能力,通过检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性、茜素红染色及基质钙含量分析以评估hDPSCs表达ALP能力及生成钙结节含量,用qRT-PCR及Western Blot检测成牙/成骨相关基因和蛋白-牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)和骨钙素(Osteocalcin,OCN)的表达变化。结果1.hDPSCs的分离培养及鉴定流式细胞仪鉴定细胞阳性表达CD29、CD90等间充质干细胞表面标志,阴性表达CD34、CD45造血干细胞表面标志,克隆形成能力检测见多个克隆,矿化诱导后染色见红染结节,成脂诱导后染色见红染脂滴,符合hDPSCs的生物学特性。2.建立过/低表达IGF-1的hDPSCs模型MOI为20是过/低表达IGF-1慢病毒转染hDPSCs的最佳转染浓度,qRT-PCR、Western Blot 及 ELISA 提示 IGF-1-over 组较 hDPSCs-1 组和 Con-over组 IGF-1 表达显著上调(p<0.01),而 IGF-1-inhibition 组较 hDPSCs-2 组和Con-inhibition 组 IGF-1 表达显著下调(p<0.01)。3.检测基因修饰后hDPSCs体外矿化能力IGF-1-over组较hDPSCs-1组和Con-over组hDPSCs增殖能力无显著差异(p>0.05),ALP活性显著升高(p<0.05),且茜素红染色程度更深,基质钙含量程度更高(p<0.05),DSPP、OCN基因和蛋白表达水平显著上调(p<0.05),而 IGF-1-inhibition 组较 hDPSCs-2 组和 Con-inhibition 组 hDPSCs 增殖能力无显著差异(p>0.05),DSPP、OCN基因和蛋白表达水平显著下调(p<0.05),ALP活性、茜素红染色及钙含量定量未见显著差异(p>0.05)。结论1.成功筛选过/低表达IGF-1慢病毒转染hDPSCs的最佳转染浓度,验证了慢病毒转染可有效调控hDPSCs中IGF-1的表达。2.过/低表达IGF-1慢病毒分别正/负向调控hDPSCs的成牙/成骨分化潜能。
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