【摘 要】
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本研究采用4D Label-free定量蛋白质组学技术在对照组和无乳链球菌（GBS）感染组的6个样本中共鉴定到了2684个差异表达修饰位点和1388个差异表达蛋白质,且泛素化上调、蛋白质含量下调是主要的差异表达类型。这些蛋白质主要聚集在细胞迁移和炎性相关通路方面,选用炎性信号转导通路泛素化相关蛋白TAK1作为后续研究靶点。采用MTT、CCK-8、LDH法、流式细胞术以及胞内菌落计数法检测了苦参碱对
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本研究采用4D Label-free定量蛋白质组学技术在对照组和无乳链球菌（GBS）感染组的6个样本中共鉴定到了2684个差异表达修饰位点和1388个差异表达蛋白质,且泛素化上调、蛋白质含量下调是主要的差异表达类型。这些蛋白质主要聚集在细胞迁移和炎性相关通路方面,选用炎性信号转导通路泛素化相关蛋白TAK1作为后续研究靶点。采用MTT、CCK-8、LDH法、流式细胞术以及胞内菌落计数法检测了苦参碱对细胞活性、毒性、凋亡以及GBS对细胞侵袭率的影响,探究苦参碱对GBS感染的b MECs的保护作用。结果表明,苦参碱浓度为50～125μg/m L时无细胞毒性,能够显著促进b MECs的增殖（P＜0.05）,显著抑制GBS诱导的细胞毒性作用（P＜0.05）,作用效果最好的三个浓度依次为100、75和50μg/m L。100、75和50μg/m L三种浓度的苦参碱能够显著抑制GBS侵袭到细胞内部（P＜0.05）,显著抑制GBS诱导的细胞凋亡（P＜0.05）,以抑制早期凋亡为主,且较高浓度苦参碱作用效果更好。通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光等技术,探究苦参碱对GBS诱导的b MECs炎症信号通路中TAK1蛋白泛素化的作用机制。试验结果显示,苦参碱能够不同程度地降低GBS诱导的b MECs炎性因子的表达;苦参碱通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的转导,减少b MECs中炎性因子的表达,从而降低GBS诱导产生的炎性损伤作用;50～100μg/m L的苦参碱能够通过抑制TAK1蛋白的泛素化降解,进而抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活,有效减少炎性因子造成的损伤。综上所述,本研究从泛素化角度揭示了苦参碱对无乳链球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症的防治机制:1)构建了无乳链球菌感染奶牛乳腺上皮细胞的泛素化蛋白质图谱,定位到了关键泛素修饰蛋白及位点;2)苦参碱能够提高乳腺上皮细胞的活性,抵御GBS诱导的细胞毒性,抑制GBS入侵到细胞内部,有效降低细胞凋亡率;3)苦参碱能够通过抑制TAK1蛋白的泛素化降解,进而抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活,有效减少炎性因子造成的损伤。
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