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背景和目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是以进行性记忆和认知功能丧失为临床特征的大脑退行性疾病,其神经病理学特征为神经细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)、神经细胞外则表现为老年斑(senile plaques,SPs)。有研究表明β-淀粉样蛋白(Aβ)对胆碱能神经元的毒性是Alzheimer病的主要机制。因此对Aβ的产生、降解和清除的分子生物学研究是目前研究Alzheimer病的热点之一。近年来,一氧化氮(NO)在中枢神经系统中的病理生理作用成为神经科学研究的又一个热点。NO是一种血管神经活性物质,具有调节脑血流、促进或抑制递质释放、参与突触可塑性、神经元兴奋毒性及炎症性损害等多种作用,且与学习记忆有关,但过量的NO可通过过氧化应激、干扰脑内能量代谢使细胞内钙调节紊乱等多种途径而诱导细胞凋亡。大量实验资料和临床观察表明,大脑海马区与学习记忆有关。如果损伤海马、穹窿、下丘脑乳头体或乳头体丘脑束及其邻近结构,可引起近期记忆功能的丧失。海马细胞原代培养是研究神经细胞的重要手段之一。 本实验原代培养海马神经元,利用一氧化氮参与缺血缺氧损伤的病理生理过程的特点来诱导神经元为痴呆模型细胞。神经细胞之间信息传递方式需要通过神经递质来实现。酸性肽是本实验室分离出的一个小分子神经肽,它广泛存在于动物的大脑中,参与多种功能的调节。它对老年性痴呆具有治疗作用。大豆黄酮(soybean flavone),是一种类黄酮化合物。有研究证实大豆黄酮可以提高抗氧化酶的活性,因而能提高机体的抗氧化能力。 本实验通过大豆黄酮对痴呆模型的海马神经元内一些蛋白质分子水平的作用研究,探讨了其延缓脑老化的生物学机制。C肽是本实验从动物体中分离的另一肽类化合物。本实验初步研究了C肽和神经元凋亡之间的关系。 材料与方法:用新生24小时内的SD大鼠经解剖分离海马,胰蛋白酶消化,获得单细胞悬液,通过接种、换液等步骤,培养10-12天,生物性状稳定可用于实验。以下是实验的主要步骤。1、解剖分离出海马组织。2、培养到第10到11天的神经元进行神经特异性烯醇化酶(NSE)的免疫细胞化学染色鉴定,神经元纯化率达95％以上时进行下列实验。3、体外培养至10天的神经元用酸性肽、大豆黄酮、C肽分别以三种不同浓度预处理6小时,然后再加入终浓度为50umol/L的硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)处理海马神经元。实验分为11组。Ⅰ组:正常对照组;Ⅱ组:SNP处理组;Ⅲ组:0.15mg/mL酸性肽+SNP组;Ⅳ组:0.3mg/mL酸性肽+SNP组;Ⅴ组:0.6mg/mL酸性肽+SNP组;Ⅵ组:0.15mg/mL大豆黄酮+SNP组;Ⅶ组:0.3mg/mL大豆黄酮+SNP组;Ⅷ组:0.6mg/mL大豆黄酮+SNP组;Ⅸ组:0.15mg/mLC肽+SNP组;Ⅹ组:0.3mg/mLC肽L+SNP组;Ⅺ组:0.6mg/mLC肽+SNP组。以上11组细胞继续培养至24小时进行以下实验,做细胞的免疫细胞化学染色。通过德国Lecia显微照相系统采集免疫细胞化学染色后的图片,然后经Biosens Digital ImagingSystem v1.6测定阳性区的灰度值,其中每张片至少选取5个视野,取均值。数据用SPSS13.0软件进行分析,显著性检验采用单因素方差分析及秩和检验分析,以α=0.05作为有显著性水准。 结果:1.成功建立了新生(24h)SD大鼠海马神经元体外培养模型,并建立了SNP诱导的体外培养海马神经元凋亡的模型。2.酸性肽、大豆黄酮、C肽能拮抗SNP的神经毒性。细胞的免疫化学染色显示酸性肽、大豆黄酮、C肽在实验范围内有剂量依赖关系。与对照组相比,SNP处理的海马神经元的淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein,APP)、β-分泌酶(β-secretase,BACE)、NO化氮合酶1(NO synzyme1,NOS1)的表达显著增加(P<0.05);与SNP组相比,各浓度AP组、高浓度大豆黄酮组、各浓度C肽组的海马神经元内APP、BACE、NOS1的表达明显降低(P<0.05),低浓度和中浓度大豆黄酮组APP和NOS1的表达明显降低(P<0.05)。 结论:1.用新生(24 h)SD大鼠海马神经元体外培养,成功建立了SNP诱导的体外培养海马神经元凋亡模型。2.酸性肽、大豆黄酮和C肽能抑制SNP对海马神经元的神经毒性。3.酸性肽、大豆黄酮和C肽抑制凋亡作用机制是通过抑制细胞内淀粉样前体蛋白、β-分泌酶和神经型一氧化氮合酶的合成而实现的。