疟疾是一种严重危害人类健康、影响流行区经济、社会发展的重要的传染病之一.随着多抗药虫株的出现和媒介按蚊对杀虫剂抗性的扩散,疟疾的防治面临新的挑战.20世纪90年代初,WHO/TDR提出了"遗传改造媒介按蚊"的疟疾防治新策略.寻找支持或抑制疟原虫在蚊体内发育的相关基因,克隆、鉴定和分析其功能,是实现这种新策略的首要工作.黑化包被反应是昆虫最重要的防御反应,是最终决定感染是否成功的关键机制,而前酚氧化酶(Prophenoloxidase, PPO)在其中起关键的作用,因此被称为PPO级联反应.PPO级联反应是昆虫的一种重要的识别、防御机制.它实质上是一种丝氨酸蛋白酶介导的级联反应.PPO级联反应主要由识别/结合蛋白(Recognition/binding protein)、PPO和丝氨酸蛋白酶(Serine proteinase)组成.机械损伤、化学因子及微量的病原体细胞壁成分均能激活昆虫PPO级联反应.首先激活PPAE(Prophenoloxidase-activating enzume, PPAE),接着PPAE通过限制性蛋白水解作用使PPO裂解释放一个小分子肽后转变成有活性的酚氧化酶(Phenoloxidase, PO),然后,PO催化酪氨酸羟化反应形成二羟基苯基丙氨酸,并催化二羟基苯基丙氨酸和多巴胺的氧化反应最终产生大量的醌类中间产物,最后通过这些中间产物聚合形成黑色素.这些黑色素协同具有细胞毒性的醌类中间产物沉积到入侵的病原体周围,起到隔离杀死病原体的作用.目前,从冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)已克隆到9种PPO基因,从斯氏按蚊(Anopheles stephensi)、库态按蚊(Anopheles culicifacies)均只克隆到一种PPO基因.大劣按蚊(Anopheles dirus)是东南亚和中国南方山区,特别是海南和云南及广西地区主要的疟疾媒介,它主要传播恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(Plasmodium vivax).大劣按蚊也可以人工感染一种鼠疟原虫-约氏疟原虫,但大多数卵囊不能发育成熟而最终黑化坏死.因此,大劣按蚊-约氏疟原虫模型是研究按蚊抵抗疟原虫感染机制较好的模型.为了系统研究按蚊抗疟的分子机制,特别是PPO基因在黑化包被疟原虫反应中的作用.该文主要进行了以下几方面的基础研究工作:一、大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建.二、 大劣按蚊核糖体蛋白S7的基因克隆.三、大劣按蚊PPO的基因克隆.四、吸血和感染约氏疟原虫对大劣按蚊PPO表达水平的影响.其实验内容和实验结果主要包括以下几个方面:1.通过采用去头、加大变性剂的使用量、使用RNA沉淀液等改进措施,较好地解决了大劣按蚊成蚊总RNA制备问题,在此基础上,首次构建了大劣按蚊成蚊cDNA文库,经质量鉴定,初级文库的滴度达2.1×10<6>pfu/ml,重组率达98﹪以上,扩增后文库滴度达1×10<10>~1×10<11>pfu/ml,平均插入片段长度在1Kb以上,已达到cDNA文库设计的基本要求.该文库的构建为系统研究大劣按蚊的基因结构与功能、克隆免疫相关基因等实验研究奠定了基础.2.通过对多种昆虫、鼠和人的核糖体蛋白S7氨基酸序列进行对比,从中抽提出保守序列,并以此为依据设计简并引物,经RT-PCR技术从大劣按蚊cDNA中克隆到了S7基因cDNA部分序列.根据已克隆部分序列,设计和标记探针,成功地从大劣按蚊cDNA文库中筛选出了S7全长克隆,命名为AdS7.大劣按蚊核糖体蛋白S7基因全长871bp,其ORF为69-644bp,长576bp,编码192个氨基酸,序列相似性检索和系统进化分析表明,AdS7与冈比亚按蚊S7基因同源性最高,核酸和氨酸序列相似性分别达94﹪和96﹪.AdS7 mRNA表达水平不受大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫的影响,因此,该基因可作为大劣按蚊其它基因定量研究的稳定内参照;AdS7基因的克隆成功也为以后有关大劣按蚊核糖体结构与功能以及大劣按蚊发育、进化和分类方面的研究奠定了基础.3.同样通过简并引物RT-PCR技术从大劣按蚊cDNA克隆得到三种不同的PPO基因的cDNA部分序列,分别命名为AdPPO1、AdPPO2和AdPPO3.通过序列相似性检索证实,AdPPO1与冈比亚按蚊PPO5的序列相似性最高,核酸序列和氨基酸序列的相似性分别为84﹪和88﹪.AdPPO2与冈比亚按蚊PPO亚单位Ⅰ(也称冈比亚按蚊PPO2)同源性最高,二者的核酸序列和氨基酸序列的序列相似性分别为83﹪和84﹪.AdPPO3与斯氏按蚊PPO基因的同源性最高,核酸序列和氨基酸序列的相似性分别为83﹪和93﹪,而与冈比亚按蚊PPO6的核酸序列和氨基酸序列的相似性分别为82﹪和93﹪.在此基础上,从大劣按蚊cDNA文库筛选到了具有完整3端的AdPPO1克隆,该克隆全长1533bp,含终止密码和3非翻译区及Poly A结构,但5不完整.AdPPO1的克隆成功为以后克隆其它PPO基因的全长序列打下了基础.4.利用RT-PCR技术研究了吸血和感染约氏疟原虫对三种PPO基因表达水平的影响,并对它们在大劣按蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况进行了研究.结果发现,吸正常血和感染血24h后,AdPPO1表达水平明显降低,但正常血组与感染血组间没有显著差异.通过RT-PCR方法检测发现,AdPPO1仅在血淋巴有表达,在蚊胃和唾液腺没有检测到AdPPO1 mRNA的存在.吸血可以使AdPPO2 mRNA表达水平上升,但感染组表达水平没有上升.AdPPO2在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有表达.血餐和感染疟原虫24h后AdPPO3 mRNA的表达水平没有明显变化,它在血淋巴和唾液腺有表达,在蚊胃表达水平较弱.该文研究结果提示,不同的PPO在按蚊血餐的消化和对疟原虫的免疫防御反应中作用不同,吸血明显影响部分PPO基因的表达水平.3种PPO的表达在动合子形成和穿越蚊胃上皮细胞时没有发生明显变化,PPO级联反应是否启动,还需要检测更多的时间点、采用更多的方法和指标来验证.也有可能是其它尚未克隆的PPO成员参与黑化包被疟原虫的反应.另外,该文研究结果还说明,除了血细胞以外,蚊胃和唾液腺等上皮组织本身也可以合成部分PPO.综上所述,该文首先成功构建了大劣按蚊成蚊cDNA文库,然后利用简并引物RT-PCR扩增的方法克隆获得了大劣按蚊核糖体蛋白S7和三种大劣按蚊PPO基因的cDNA部分序列,在此基础上,又从cDNA文库筛选出了大劣按蚊核糖体蛋白S7全序列,以及大劣按蚊PPO1的完整3端序列.最后,对3种PPO基因与大劣按蚊吸血及感染约氏疟原虫的关系进行了初步研究,上述研究工作为以后克隆大劣按蚊PPO全序列和功能研究奠定了基础.