肿瘤是导致人类生病死亡的第一因素,肿瘤的发生多与基因突变有关,其中95%是由单碱基突变引起的。同时有研究表明,端粒酶介导的端粒无限延长也是肿瘤发生的关键原因。基因单碱基突变和端粒酶活性已经被看作是肿瘤早期诊断生物标志物。然而肿瘤发生早期多无明显症状,使得临床诊断困难,待发现时大多已属于晚期导致治愈率极低。因此,对肿瘤发生相关分子进行检测在肿瘤的早期诊断以及治疗上有着重要的意义。本研究通过核酸非稳态杂交,阳离子共轭聚合物FRET以及距离依赖性石墨烯介导能量转移等手段,建立了三种新型的核酸及蛋白质构象检测方法,对肿瘤相关酶的活性及单碱基突变基因进行了高选择性检测。首先,由于端粒的延长与肿瘤的发生密切相关,因此开发一种快速且准确的端粒酶检测方法对于疾病诊断至关重要。目前,基于扩增的方法对体内外端粒酶活性的检测已经有了广泛研究。然而这些方法通常具有重复性差和背景干扰强等缺点,导致它们很难应用于真实样品测定。在这部分研究中,我们利用全内反射荧光显微镜基于核酸随机杂交建立了一种新型无扩增单分子成像方法用于体外端粒酶活性检测。采用荧光标记短链DNA探针检测真实目标,二者随机动态结合会产生与背景噪声完全不同的动力学特征信号,从而使得我们能够在单分子水平上对端粒酶产物进行无背景测定。这种无背景测定使得检测限可以低至0.5 fM,并且对于端粒酶产物的检测范围可以达到0.5-500fM。在实际样品测定中,该方法仅利用10个肿瘤细胞就可实现端粒酶活性的高效检测。此外,将此方法拓展成多重随机结合检测法,首次对端粒酶产物长度的分布进行了测定,这有助于深入了解端粒酶催化机理的研究。接下来,以DNA杂交探针为工具的核酸检测及成像方法在基因突变检测领域表现出了很大的潜力,但是其对于单碱基突变的选择性很差。因此,根据前一部分研究发现的短链DNA的特异性杂交以及阳离子共轭聚合物(CCP)信号放大的特点,开发了一种有效且简单的单碱基突变(SNM)高选择性检测和原位成像的方法。对仅存在由单碱基突变引起差异的核酸样品进行了高效区分,可以灵敏的检测出丰度(样品中突变基因比例)低至0.1%的SNM。单分子荧光共振能量转移(smFRET)研究表明,CCP的存在可以增强短链DNA的杂交稳定性,并且对于完全匹配的双链体和存在错配的双链体的增强程度不同,这也是该方法单碱基选择性高的原因。同时CCP还可以保护DNA探针不被核酸酶水解,并且由于探针设计简单,CCP亮度稳定,该方法在固定细胞中实现了高选择性mRNA原位荧光成像。细胞成像实验显示,具有BRAF V600E点突变的黑色素瘤细胞系A375表现出比未被报道过在此位点有突变的肝癌细胞系HepG2更高的FRET效率。这种方法是一种基于DNA杂交探针的新方法,其可能在DNA传感和细胞内成像领域得到广泛应用。最后,蛋白质的详细结构信息是理解其功能的基础,对于疾病诊断和药物开发至关重要。目前,许多蛋白质的原子结构已通过X射线晶体学和低温电子显微镜(cryo-EM)得到了解析。但是这些强大的结构生物学技术需要精密昂贵的仪器,复杂的样品制备和数据分析的支撑,难以用于大批量样品的分析。因此在这部分工作中,利用不同长度的DNA链作为荧光分子载体固定至石墨烯表面,使荧光分子与石墨烯表面具有不同的距离。依据荧光被淬灭情况,量化石墨烯荧光淬灭效率与距离的关系,绘制关系曲线,以此建立一种“纳米标尺”。同时使用trisNTA作为蛋白质捕获部分建立功能性石墨烯基脂质层,将蛋白质固定至石墨烯上。再将此标尺应用于蛋白质复合物轴定向信息的检测。成功检测出Ypt7蛋白在其影响因子Monl-Cczl作用下发生了 2.1 nm的构象变化。首次通过实验对石墨烯荧光淬灭效率与距离的关系进行了定量,该纳米标尺可以应用于多种生物大分子结构变化的检测。综上所述,本研究建立的三种新型的肿瘤分子诊断检测方法均具有操作简单、检测快速、成本低廉、特异性高和灵敏度高等优点,并且具有良好的临床应用潜力。